单克隆抗体制备.doc

单克隆抗体制备 1. 免疫动物：三只Balb/c小鼠 2. 佐剂：首先用完全弗氏佐剂（CFA），后用不完全弗氏佐剂（IFA）。 3. 免疫原：蛋白或KLH偶联多肽。每次免疫使用50-100μg免疫原。 4. 免疫：用PBS稀释免疫原，然后与相应的佐剂1：1混合。抗原和佐剂完全混合形成稳定的乳剂，将该乳剂在小鼠双肩周围的皮肤下进行皮下注射和后腿进行肌肉注射。每个区域大约用1/8的免疫原。接着将1/2的免疫原进行腹腔注射，这样免疫原可以持久存在从而提高免疫应答。以后每个星期进行腹腔注射直到达到要求的效价。 5. 第0星期 预采血 完全弗氏佐剂（CFA）混合的100μg抗原免疫小鼠。 第2星期 完全弗氏佐剂（CFA）混合的50μg抗原免疫小鼠。 第3星期 不完全弗氏佐剂（IFA）混合的50μg抗原免疫小鼠。 第4星期 溶解在PBS中的50μg抗原免疫小鼠。 第5星期 取适当的细胞或组织进行ELISA和WB检测， 溶解在PBS中的50μg抗原免疫小鼠。 第X星期 取适当的细胞或组织进行ELISA和WB检测， 溶解在PBS中的50μg抗原免疫小鼠。 6. 杂交瘤融合和筛选：用PEG方法将效价最好的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞F0进行融合。用抗原对融合的杂交瘤克隆进行筛选，检测它们的特异性和敏感性。ELISA阳性的克隆可用WB检测，筛选出来的克隆至少还需要亚克隆两次。 7. 大规模抗体生产：筛选得到两个克隆最后进行大规模培养（每个克隆1L）或者取腹水（每个克隆5只小鼠）。用蛋白A/G对培养液或腹水进行纯化，平均每个克隆可以得到3-5mg 抗体。 8. 注意：每个融合平均可以得到900多个克隆，对于多肽抗原可以得到100个左右的ELISA阳性克隆，重组蛋白抗原可以得到100-150个ELISA阳性克隆。亚克隆实验做的越早，越容易保存克隆。因此，为了保存和复苏阳性克隆，尽早进行筛选检测是必需的。 抗体纯化－盐析法纯化免疫球蛋白（1） 原理蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度，以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。 (二)　影响盐析的因素1.　蛋白质的浓度：盐析时，溶液中蛋白质的浓度对沉淀有双重影响，既可影响蛋白质沉淀极限，又可影响蛋白质的共沉作用。蛋白质浓度愈高，所需盐的饱和度极限愈低，但杂蛋白的共沉作用也随之增加，从而影响蛋白质的纯化。故常将血清以生理盐水作对倍稀释后再盐析。2.　离子强度:各种蛋白质的沉淀要求不同的离子强度。例如当硫酸铵饱和度不同，析出的成分就不同，饱和度为50％时，少量白蛋白及大多数拟球蛋白析出；饱和度为33％时γ球蛋白析出。3.　盐的性质：最有效的盐是多电荷阴离子。4.　PH值：一般说来，蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度越大。改变PH改变蛋白质的带电性质，也就改变了蛋白质的溶解度。 5.　温度：盐析时温度要求并不严格，一般可在室温下操作。血清蛋白于25℃时较0℃更易析出。但对温度敏感的蛋白质，则应于低温下盐析。 6.　蛋白质沉淀后宜在4℃放3小时以上或过夜，以形成较大沉淀而易于分离 淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体技术 ? 1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。 　　制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤，下面按照制备单克隆抗体的流程顺序，逐一介绍其实验方法。 　　一、细胞融合前准备 　　一　免疫方案 　　选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 　　1.　颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。下面以细胞性抗原为例的免疫方案: 　　　　　　　　　　初次免疫　　　　　　　1×10７／0.5ml ip 腹腔内注射 　　　　　　　　　　　　↓　2～3周后 　　　　　　　　　　第二次免疫　　　　　　1×10７／0.5ml ip 　　　　　　　　　　　　↓　3周后 　　　　　　　　　　加强免疫融合前三天　1×10７／0.5ml ip或iv静脉内注射 　　　　　　　　　　　　↓ 　　　　　　　　　　取脾融合 　　2.