实验三SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量2014.10.08分析.ppt

六　染色和脱色 染色 用一块胶，另一块胶用于转膜。 加入染色液，染色45分钟。 脱色 染色完毕，倾出染色液，加入脱色液。20～30min换一次脱色液，2～3次后可初步观察电泳条带，然后脱色过夜，直至背景清晰。 七、 Mr的计算 标难曲线只对同一块凝胶上的样品的分子量测定才具有可靠性。 以每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁移率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁移率即可测出其分于量。 八　转膜 胶放在3张缓冲液浸湿的滤纸上，盖上经甲醇激活（15-30sec）的PVDF膜（切多余的膜及纸，与凝胶一样大小）排气泡，盖同样3张缓冲液浸湿的滤纸，排气泡。 顺序： 负极－ 3层滤纸－凝胶－膜－ 3层滤纸－正极，如图。 用塑料夹夹紧，放入转移电泳仪，电泳槽搁置冰上，恒压１小时。丽春红染色1分钟检测目标蛋白。 九　封闭 PVDF膜用TBST淋洗，放入封闭液中 蛋白转膜组装顺序（sandwich制作） 组装顺序： 转膜夹黑色面（负极）－海绵垫－滤纸－胶－ 膜 －滤纸－海绵垫－红色面（正极） 海绵 Cathode _ Anode + 滤纸 膜 胶 滤纸 海绵 醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质 【基本原理】 本实验用醋酸纤维薄膜作电泳支持物分离血清蛋白质。血清蛋白质的等电点都小于7.5，在pH=8.6的巴比妥缓冲溶液中都带有负电荷，在电场中将向正极移动。由于血清中各蛋白质的等电点不一，所带净电荷有差异，所以它们的泳动速率也不同。将微量血清点于薄膜上，通电电泳后，将薄膜置染色液中使蛋白质固定并染色，可将血清蛋白质分成5条区带，从正极端起分别为白蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白。 【操作步骤】 一、准备与点样 1．将醋酸纤维薄膜切成2.5 cm×8 cm的小片。在薄膜无光泽面距一端1.5 cm处用铅笔轻轻划一线，表示点样位置。 2．将醋酸纤维薄膜无光泽面向下，漂浮于巴比妥缓冲溶液面上（缓冲溶液盛于培养皿中），使膜条自然下沉。 3．将充分浸透（指膜上没有白色斑痕）的膜条取出，将薄膜无光泽面向上，平放在干净滤纸上，用干净滤纸吸去薄膜上多余的缓冲溶液。 4．将膜条（无光泽面向上）放于一干净滤纸上，用宽1 cm的有机玻片在盛有血清的小烧杯中蘸一下，使软片下端粘上薄层血清，然后按在薄膜点样线上，让血清渗入膜内，移开软片。 二、电泳 将点样后的膜条置于电泳槽架上，放置时无光泽面（即点样面）向下，点样端置于阴极（切勿弄错）。槽架上四层滤纸作桥垫，膜条与滤纸桥需贴紧并拉直，中间不能下垂。如一电泳槽中同时安放多张薄膜，则薄膜之间应相隔几毫米。盖上电泳槽盖，待平衡5分钟后通电，电压为10 V/cm长（指膜条与滤纸桥总长度），电流为0.4～0.6 mA/cm宽，电泳时间约1小时左右。 三、染色 通电完毕后用镊子将薄膜取出，直接浸于盛有氨基黑10B的染色液中，染5分钟取出，立即浸入盛有漂洗液的培养皿中，反复漂洗数次，直至背景漂净为止。用滤纸吸干薄膜。 1.低浓度的盐溶液为什么会对蛋白质有溶解作用？ 2.课本上说细胞破碎后蛋白质溶解在抽提液中，需要将蛋白质溶液进行浓缩，而最常用的浓缩方法是沉淀法，那么沉淀法具体是什么样的原理和操作方式？ 3.Lowry法为什么加入新配置的碱性铜溶液之后，要强调立即摇匀？ 4.Lowry法?为什么加入Folin-酚试剂之后，要强调边加入边立即充分混合？ 5.Lowry法?为什么加入Folin-酚试剂之后，在室温下放置的时间不能超过60min？ 6.Lowry法?课本上要求使用的波长是550nm，而课件上是745-750nm，到底哪一种比较准确？ 7.Lowry法中? K+, Na+等离子，蔗糖，甘油，EDTA等为什么会影响测定结果？ 8.Lowry法中?为什么把蛋白质发生不可逆变性算作该测量方法的缺点？是因为蛋白质可以重复利用吗？ 9.考马斯亮蓝法中注意到每组试管所加的液体量都非常少，在配制液体的时候很容易将部分液滴残留在试管壁上，这样肯定会导致实验结果的偏差，那么为何不多加一些蛋白质溶液呢？或者增大最后加完双蒸水之后的总体积？ 10.紫外法中核酸可引起强干扰作用是实验的一个缺点，那么为什么会有核酸的出现呢？? 实验三　 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）测定蛋白质相对分子质量 2014.10.08 一、实验目的 二、实验原理 三、实验步骤 本节课的内容 一、实验目的 学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的原理。 掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作技术。 二、实验原理 电泳的基本知识和原理 SDS的性质与作用 聚丙烯酰胺凝胶的性质 什么是电泳？