sds聚丙烯酰胺凝胶电泳page测定蛋白质分子量.ppt

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）测定蛋白质分子量 一、实验目的： 1.学习 SDS分离蛋白质的原理； 2. 学习垂直板电泳的操作方法。 二、实验原理 1、电泳： (2)影响电泳效果的因素： ①带电颗粒的大小和形状： 颗粒越大，电泳速度越慢，反之越快； ②颗粒的电荷数： 电荷越少，电泳速度越慢，反之越快； ③溶液的粘度： 粘度越大，电泳速度越慢，反之越快； ④溶液的pH值： 影响被分离物质的解离度，离等电点越近，电泳速度越慢，反之越快； ⑤电场强度： 电场强度越小，电泳速度越慢，反之越快； ⑥离子强度： 离子强度越大，电泳速度越慢，反之越快； ⑦电渗现象： 电场中，液体相对于固体支持物的相对移动； ⑧支持物筛孔大小： 孔径小，电泳速度慢，反之则快。 2、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS） (1)定义 聚丙烯酰胺凝胶电泳 （PAGE）：是以聚丙烯胺凝胶作为载体的一种区带电泳。 SDS:是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS （十二烷基磺酸钠） (2)SDS的作用 SDS是一种阴离子去垢剂，可与蛋白质结合，形成SDS-蛋 白质复合物。 由于SDS带有大量负电荷，好比蛋白质穿上带负电的“外 衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖,即消除了蛋白质分 子之间电荷差异。 因此在电泳时，蛋白质分子的迁移速度则主要取决于蛋白 质分子大小 (3) SDS分类： SDS按照缓冲液pH值和凝胶孔径差异分为连续系统和不连续系统两大类： 连续系统：电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带 电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。 不连续系统：缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯 度均不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效 应， 分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度 及分辨率均较前者佳 (4)聚丙烯胺凝胶的生成： 聚丙烯胺凝胶由丙烯酰胺单体（Acr）和N，N’-甲叉 双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下聚合而成。在具有 自由基时，Acr和Bis就会聚合。 引发产生自由基的方法有两种： ①化学法 ②光聚合法 ①化学聚合： 引发剂是过硫酸铵(AP)，催化剂N、N、N’、N’ －四甲 基乙二胺（TEMED），它的碱基催化AP产生氧自由基，激 活单体形成自由基，发生聚合。化学聚合形成的凝胶孔径 较小，且重复性好，用来制备分离胶； ②光聚合： 催化剂是核黄素（VB2 ），在痕量氧存在下，核黄素光 解形成无色基，无色基再被氧氧化成自由基，激活单体发 生聚合。光聚合形成的凝胶孔径较大，且不稳定，适于制 备大孔径的浓缩胶。 5)聚丙烯酰胺凝胶结构上的特点： ① 聚丙烯酰胺的基本结构为丙烯酰胺单体构成的长 链，链与链之间通过甲叉桥联结在一起； ② 链的纵横交错形成三维网状结构，使凝胶具有分 子筛的性质； ③ 网状结构还能限制蛋白质等样品的扩散运动，使 凝胶具有抗对流的作用； ④ 长链富含酰胺基团，使其成为稳定的亲水凝胶； ⑤ 该结构不带电荷，在电场中电渗现象极为微小。 (6)凝胶的质量决定因素： （1）凝胶度： 是指100mg凝胶溶液中含有单体（Acr）和交联剂 （Bis）的总克数，用T%表示。 （2）交联度： 是指凝胶溶液中，交联剂占单体和交联剂总量的 百分数，用C%表示。 一般浓缩胶的浓度为7.5%，分离胶的浓度为10%。 (7)不连续PAGE的原理： 第一、三个不连续性： ①凝胶孔径的不连续； ②缓冲液离子组成及各层凝胶pH的不连续； ③在电场中形成的电位梯度的不连续。 第二、不连续系统中的三种物理效应：