SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告.docx

SDS－PAGE测定蛋白质相对分子质量 一、前言 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳，简称PAGE，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。 HYPERLINK /doc/391243-414301.html \t _blank 催化聚合的常用方法有两种:化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过硫酸铵(APS)为催化剂，以 HYPERLINK /doc/6877362-7094813.html \t _blank 四甲基乙二胺(TEMED)为加速剂。在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发 HYPERLINK /doc/5395218-7117649.html \t _blank 丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维 HYPERLINK /doc/13232-13664.html \t _blank 网状结构。 PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和 HYPERLINK /doc/1458907-1542447.html \t _blank 分子筛效应。不连续系统中由于 HYPERLINK /doc/4519680-4729645.html \t _blank 缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及 HYPERLINK /doc/4150630-4350502.html \t _blank 分离胶所组成。浓缩胶是由AP HYPERLINK /doc/391243-414301.html \t _blank 催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HCl。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HCl。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。 SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。而强 HYPERLINK /doc/722002-764387.html \t _blank 还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的 HYPERLINK /doc/6722416-6936505.html \t _blank 二硫键断裂。在 HYPERLINK /doc/6023117-6236114.html \t _blank 样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被 HYPERLINK /doc/9056636-9387450.html \t _blank 解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS HYPERLINK /doc/6051997-6265016.html \t _blank 胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。 SDS一般采用的是不连续缓冲系统，与连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。 浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品液和浓缩胶选TRIS/HCl缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸。电泳开始后，HCl解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低 HYPERLINK /doc/6768370-6983484.html \t _blank 电导区，而 HYPERLINK /doc/3568219-3752438.html \t _blank 电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成一稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。 此鉴定方法中，蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子质量，而与所带电荷和分子形状无关。 聚丙烯酰胺凝胶电泳作用原理 聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。它有两种形式:非 HYPERLINK /doc/4150054-4349906.html \t _blank 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native)及SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS);非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋