毛细管电泳的应用.ppt

高效毛细管电泳的应用 1、毛细管电泳的定义 2、几种毛细管电泳的分离原理 3、毛细管电泳的基本配置 4、毛细管电泳的应用领域 一、毛细管电泳的定义 电泳：电解质中带电粒子在电场 作用下，以不同的速度向电荷相 反方向迁移的现象。 传统电泳会在电解质离子流中产 生自热，引起径向粘度和速度的 梯度，从而导致区带展宽、降低 效率。 毛细管电泳是在散热效率极高的、空 芯的、微小内径（10-200μm的毛细 管内进行的大、小分子高效分离技术。 毛细管电泳的主要优点： 1、高灵敏度 2、高分辨 3、速度快 4、进样少 5、成本低 高灵敏度：紫外检测器的检测极 限在10-13—10-15mol之间，荧光检 测可达10-19—10-21mol。 高分辨：峰分离效率超过1百万理论塔 板数，一般可达几十万。 理论塔板数=5.54(tR/w1/2)2。 分离度=2（tR2-tR1）/w1+w2，一般要大 于1.5。 速度快：许多分析在10分钟内完成。 进样少：一般需要毫微升的进样量。 成本低：一般只需要可长期使用 的毛细管和极微量的可自己配制 的缓冲液。 毛细管电泳的分离原理：在自由 区带电泳（CZE）中，电泳的移 动（带电荷分子朝相反极性的电 极方向移动）和电渗流（在毛细 管内壁上的电荷和应用的势能而 引起的电解质流动）的结合导致 了分离。 电渗流的大小取决于电场强度、电 解质的pH、缓冲液的组成和离子强 度、内磨擦和毛细管表面等特点。 毛细管电泳的分类： 1、毛细管区带电泳（CZE） 2、分子体积排除（筛滤）电泳或 凝胶电泳（CGE） 3、等电聚焦电泳（IEF） 4、胶束电动力学电泳（MECC） 5、等速聚焦电泳（ITP） 二、几种毛细管电泳的分离原理 （CZE、CGE、MECC、IEF、ITP） 毛细管区带电泳（CZE）的分离 原理： 基于各被分离物质的净电荷与质 量之间比值的差异，不同离子按 照各自表面电荷密度的差异以不 同的速度在电解质中移动，而导 致分离。 毛细管区带电泳分离中的有关因 素： 工作电压：分离柱效随电压的增 大而提高。 缓冲液：磷酸、醋酸、硼酸。 注意pH和浓度的控制。 pH选择三原则： 1、缓冲液的pH必须比被分离物 质的等电点高或低1个pH单位， 以便得到合适的电泳淌度。 2、在条件许可的情况下尽可能采用酸 性缓冲液，使得毛细管壁上的吸附和 电渗流降低，提高毛细管涂层的寿命。 3、在分离蛋白质中，蛋白质的等 电点低于缓冲液pH时，极性放置 是：+ → -，反之应是：- → +。 缓冲液的浓度选择： 在一般情况下，浓度增加被分离 物质的迁移速度下降，有利于分 离效果的提高，但随着缓冲液浓 度的增大，粘度增加，电渗流和 焦耳热增大，给分离造成反作用。 缓冲液中不同添加剂的选择： 添加剂 功 能 无机盐 改变蛋白质结构 有机溶剂 增加溶解度，减少电渗流 尿素 增加蛋白质溶解度， 使低聚核苷酸变性 磺酸 离子对作用，疏水作用 阴离子表面活性剂 改变毛细管壁的特性 纤维素衍生物 减少电渗流，提供一个 筛滤介质 胺类 覆盖硅烷基团 毛细管凝胶电泳（CGE）的分离原理： 用凝胶物质作为支撑物进行分离的区 带电泳，被分离物在通过装入毛细管 的凝胶时，按照各自分子的体积大小 逐一分离。 凝胶分为无机凝胶和有机凝胶或分为 物理和化学凝胶。无机凝胶有多孔硅 胶、多孔玻璃，有机凝胶有葡聚糖、 交联聚丙酰胺和环脂糖等。 毛细管胶束电动力学毛细管电泳 （MECC）的原理：当把离子