【2017年整理】生物化学实验二染料结合法测定蛋白质含量.doc

实验二 染料结合法测定蛋白质含量 一、目的要求 学习用染料结合比色法测定蛋白质含量的原理和方法；了解染料结合比色法测定蛋白质含量的优缺点。 二、实验原理 植物体内常含有许多酚类物质和游离氨基酸，这些物质能与Folin-酚试剂产生颜色反应，这使得测定值会高于实际含量。1976年，Bradford根据蛋白质与染料相结合的原理建立了考马斯亮蓝染色法测定生物体内的蛋白质含量。此法简单快捷，且不受游离氨基酸和酚类物质的影响，适合于大量样品的分析。 考马斯亮蓝G-250(CBG)在酸性溶液中呈茶棕色，在465nm有最大吸收峰。当与蛋白质结合后，其转变成深蓝色，吸收峰移至595nm。在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质浓度与吸光度成正比，可做定量分析。 三、材料、器材与试剂 〈1〉材料 植物可溶性蛋白提取液 〈2〉器材 与双缩脲反应相同 〈3〉试剂 (1)CBG试剂：称取100mgCBG溶于50ml 95%乙醇，加蒸馏水约800ml，加100ml 85%正磷酸，最后加蒸馏水至1000ml。 (2)蛋白质标准溶液 母液：称取0.1g牛血清蛋白(BSA)溶于100ml 0.15mol/L NaCl溶液，配成浓度为1000μg/ml的母液。 标准液：取母液10ml，溶于90ml 0.15mol/L NaCl溶液中，配成浓度为100μg/ml的标准液。 (3)0.15mol/L NaCl溶液：称取0.87gNaCl，溶于蒸馏水中，稀释至100ml。 四、实验步骤 〈1〉取6支试管，按表加入试剂。 染料(CBG)结合法测蛋白质含量的标准曲线 加完试剂后，混匀，室温静置3min，以0号管为空白，在595nm处比色，读取各管吸光度，作光吸收值-蛋白质浓度标准曲线。 〈2〉样品测定 准确吸取0.1ml样品液，加0.9ml 0.15mol/L NaCl溶液，再加5mlCBG，摇匀，室温静置3min，以0号管调零点，读取595nm处的吸光度，从标准曲线上查出蛋白质的浓度。 五、结果处理 计算样品中蛋白质含量 实验测得样品管的595nm处的吸光度为0.083 由图可知，样品管中蛋白质浓度为78μg/ml 则0.1ml样品中蛋白质含量：78×0.1=7.8μg Sheet1 试剂/ml BSA标准液 0.15mol/L NaCl溶液 CBG 每管标准蛋白质含量/μg A595 试管 .00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 .00 .20 .40 .60 .80 1.00 1.00 .80 .60 .40 .20 .00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 .00 20.00 40.00 60.00 80.00 100.00 .00 .02 .23 .05 .09 .16