聚合酶链式反应技术及应用.pptx

2025-3-241聚合酶鏈式反應技術及應用

2025-3-242聚合酶鏈式反應（polymerasechainreaction,PCR）技術是生命科學界的重大發明，是生物技術領域中最重要的四項生物技術（即細胞融合技術、分子克隆術、蛋白工程技術和基因擴增技術）之一。PCR的最大特點，是能將微量的DNA大幅增加。通過體外（試管內）擴增，可以將目的基因（或靶基因）片段百萬倍的放大，從而達到極大地提高核酸分子檢測的靈敏度，理論上其檢測的靈敏度可以達到一個細胞、甚至一個分子的水準。

2025-3-243PCR發展簡史PCR的發明人，一般公認是凱利﹒穆利斯（K.Mullis,在Cetus公司工作期間，發明了PCR。1983年4月穆利斯萌發了PCR的構想;1985關於PCR的文章首次由Cetus公司Saiki等人在Science上發表;1987當年7月Cetus公司在美國獲得PCR基本技術專利批准,並於當年11月推出了第一個PCR試劑產品及第一臺熱迴圈儀；1989Science報導了耐熱性DNA多聚酶Taq酶的發現,預示著分子時代的到來；1990Cetus科學家D.Gelfand和S.Stoffel發明了純化TaqDNA多聚酶的方法；1991TaqMan技術發表；九十年代中期PCR臨床應用在國內全面展開；1998年即時螢光PCR技術開始在中國較廣泛的應用於臨床檢測。

2025-3-244引物引物Mullis的構思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段

2025-3-245KaryB.MullisTheUnusualOriginofthePolymeraseChainReaction1989年美國《Science》雜誌列PCR為十餘項重大科學發明之首,比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學獎。

2025-3-246PCR的應用研究基因克隆，DNA測序，分析突變診斷細菌、病毒、寄生蟲檢測，診斷人類基因組工程遺傳圖譜的構建，DNA測序，表達圖譜法醫犯罪現場標本分析腫瘤各種腫瘤檢測其他……

2025-3-247PCR技術的基本原理是DNA的半保留複製，在範本DNA、引物和四種dNTP存在的條件下，依賴於DNA聚合酶的酶促反應。在體內，DNA複製是週期性的，所以基因擴增的數量有限；PCR技術在體外利用人工合成的引物，再加上DNA聚合酶和一些合適的底物和因數，通過對溫度的控制，使DNA不斷位於變性、複性和合成的迴圈中，達到擴增DNA的目的。2.PCR基本原理

2025-3-248範本DNA94℃變性55℃退火72℃引物延伸第二次迴圈範本變性退火延伸圖6-1PCR原理示意圖

2025-3-2491234522557294時間（min）溫度（℃）PCR的基本原理適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重複1~3步25~30輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物複性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍

2025-3-2410nynyPCR擴增效率圖y=A(1+R)ny=A2n

2025-3-2411PCR產物生成曲線擴增產物迴圈次數指數擴增期擴增平臺期

2025-3-2412PCR的特點靈敏度高皮克(pg=10-12)量級擴增到微克(ug=10-6)水準能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞病毒檢測的靈敏度可達3個RFU細菌檢測的最小檢出率為3個細菌簡便、快速一次性加好反應液，2～4小時完成擴增擴增產物一般用電泳分析對標本的純度要求低血液、體腔液、洗嗽液、毛髮、細胞、活組織等組織的粗提DNA

2025-3-2413反應體系：（五要素）範本（template）引物(primer)人工合成的兩段寡核苷酸序列，決定PCR的特異性。3.PCR反應體系和反應條件DNARNA：總RNA、mRNA、tRNA、rRNA、病毒RNA基因組DNA質粒DNA

2025-3-2414PCR反應成功擴增的一個關鍵條件在於寡核苷酸引物的正確設計。引物設計的目的是在兩個目標間取得平衡：擴增特異性和擴增效率。特異性是指發生錯誤引發的頻率，特異性不好或劣等的引物會產生額外無關和不想要的PCR擴增子；引發效率是指在每一PCR迴圈中一對引物擴增的產物與理論上成倍增長量的接近程度。

2025-3-2415引物的長度典型的引物為18-24個核苷酸，在一定範圍內引物需要足夠長，保證序列獨特性，並降低序列存在於非目的序列位點的可能性；引物長度的上限主要與反應效率有關，所以一般又不能太長，因為過長會導致其延伸溫度大於72℃，即Taq酶的最適溫度。引物設計基本原則

2025-3-2416PCR產物長度一般來說，