聚合酶链式反应PCR.ppt

六、PCR扩增产物的分析1、凝胶电泳分析法：聚丙烯酰胺凝胶电泳灵敏度远高于琼脂糖电泳，用于探讨PCR扩增的灵敏度效果好，但配制复杂，常用琼脂糖凝胶电泳。2、点杂交3、微孔板杂交法第31页,共34页，2024年2月25日，星期天七、PCR技术的主要用途1、目的基因的克隆：PCR技术为在重组DNA过程中获得目的基因片段提供了简便快速的方法。2、基因的体外突变：可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。第32页,共34页，2024年2月25日，星期天3、DNA和RNA的微量分析：PCR技术高度敏感，对模板ＤＮＡ的含量要求很低，是DNA和ＲNA微量分析的最好方法。实际工作中，一滴血液、一根毛发或一个细胞已足以满足PCR的检测需要，因此在基因诊断方面具有极广阔的应用前景。4、DNA序列测定：PCR技术的引入使DNA测序工作大大简化，也提高了测序的速度。5、基因突变分析：利用PCR与一些技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性。第33页,共34页，2024年2月25日，星期天感谢大家观看第34页,共34页，2024年2月25日，星期天关于聚合酶链式反应PCR一、PCR的定义：PCR（polymerasechainreaction)：聚合酶链式反应，又称体外DNA扩增技术。近年来发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的技术。第2页,共34页，2024年2月25日，星期天DNA扩增的传统方法：一般采用分子克隆法，需将构建的含有目的基因的载体导入细胞进行扩增，并需要用探针进行筛选，牵扯到DNA酶切、连接、转化、培养及探针杂交等技术，虽然技术上已无难点，但操作复杂，需数周到数月的时间，且不利于普及。第3页,共34页，2024年2月25日，星期天PCR技术：1985年由美国Cetus公司的KaryMullis首创，可以将微量目的DNA片段扩增一百万倍以上。优点：敏感度高、特异性强、产率高、重复性好以及快速简便等，广泛应用于微生物学、考古学、法医学及体育等领域，并已普及到许多普通实验室，大大简化了传统的分子克隆技术，从而比较容易地对目的基因进行分析、鉴定。KaryMullis本人因此获1993年诺贝尔化学奖。第4页,共34页，2024年2月25日，星期天二、PCR的原理：用于扩增位于两段已知序列之间的DNA片段，类似于天然DNA的复制过程。以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板5′末端和3′末端互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成，重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。第5页,共34页，2024年2月25日，星期天扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异结合，基本反应步骤分三步：1.变性(Denaturation)：加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链。94℃30″2.退火(复性)(Annealling):突然降温后模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，也存在两条模板链之间的结合，但由于引物的高浓度，结构简单的特点，主要的结合发生在模板与引物之间。55℃30″第6页,共34页，2024年2月25日，星期天3.延伸(Extension):将反应温度调节到酶的最适温度，在DNA聚合酶、4种dNTPs及镁离子等存在的条件下，以引物的3′端开始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的新DNA链。72℃1′上述3步为一个循环，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～40个循环后DNA可扩增106～109倍。第7页,共34页，2024年2月25日，星期天PCR的基本反应步骤变性95?C延伸72?C退火Tm-5?C第8页,共34页，2024年2月25日，星期天第9页,共34页，2024年2月25日，星期天第10页,共34页，2024年2月25日，星期天PCR扩增的特异性是由一对寡核苷酸引物所决定的。反应初期，原来的DNA担负起使模板的作用，随着循