2.聚合酶链式反应技术.ppt

* * * 5u/μl Taq DNA聚合酶: 0.5 ～ 5 U / 100 μl 1U / 25 ～ 50μl * PCr仪上进行目的基因的扩增。 整个过程持续2-3h。 学习PCR仪的使用；Pcr扩增程序的设置；练习移液器的使用。 安排人员取样 安排卫生。 * * * PCR扩增目的基因NS1（500bp） 1. 反应混合液的配制 在0.2ml PCR管内配制25ul反应体系。 冰上进行。 在0.2ml PCR管内配制20ul反应体系。 实验二、 聚合酶链式反应技术 一、实验目的 通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术。 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR) ：是体外酶促合成DNA片段的一种技术。利用PCR技术可在数小时之内大量扩增目的基因或DNA片段，以用于基因工程操作。 二、实验原理 PCR的原理： 用于扩增位于两段已知序列之间的DNA片段，类似于天然DNA的复制过程。 以拟扩增的DNA分子为模板，用一对与待扩增的靶DNA区段两端序列互补的人工合成的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成，重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。 基本反应步骤分三步： 1. 变性 (Denaturation)： 加热使模板DNA在高温下变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链。 2. 退火 (复性) (Annealling): 使溶液温度降至50-60℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合。 3. 延伸 (Extension): 溶液反应温度升至72 ℃ ，以单链DNA为模板， 在DNA聚合酶的作用下、利用4种 dNTPs 等，从引物的 3′ 端开始，结合单核苷酸，按5 ′ 3 ′方向形成与模板链互补的新DNA链。 上述 3 步为一个循环，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～40个循环后DNA可扩增106 ～ 109 倍。 72℃ 94℃ 55℃ PCR循环 费事、费力、易出错 早期的PCR技术 PCR的自动化-----快速、简便 PCR基因扩增仪 三、试剂、材料和仪器 （1）材料： E.coli DH5 alpha（ pGADT7-x ） X来源于P5，300bp 引物序列： At-F:CCGCTCGAG ATGGCAAACTTATTCTT At-R:GAAGATCT TCATTCTAGAACACCTTG （2）仪器 PCR仪 制冰机 微型离心机 移液器 （3）试剂 模板DNA:1-5ng/ml 5u/μl Taq DNA聚合酶: 0.5 ～ 5 U / 100 μl 10XPCR缓冲液（ Tris- Cl，KCl，BSA） 25mM MgCl2：1.5 ～ 2.0 mM 2mM dNTPs ：0.02 ～ 0.2 mM 10pmol/μL引物（Primer）：0.2 ～ 1 μM 水（无菌纯水）：补足整个反应体积。 5? L H2O 模板 2 ? L mix 10 ? L 5′端引物 1.5 ? L 3′端引物 1.5 ? L 总体积 20?L 6? L H2O 模板 3 ? L Mix混合液 10 ? L 5′端引物 0.5 ? L 3′端引物 0.5 ? L 总体积 20?L 1. 反应混合液的配制 四、实验步骤 2.设置反应参数，进行PCR扩增。 按下述程序进行扩增 Step1 94 ℃ 4 min Step2 94 ℃ 50s Step3 55 ℃ 40s Step4 72 ℃ 30s 2 35 Step5 72 ℃ 10 min Step6 8 ℃ Forever 3、检测：琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果。 六 、问题与讨论 五、结果与分析 思考题 引物设计的原则有哪些？ 如何对PCR条件进行优化？ * * 在生物学研究中，我们常常需要在体外分离和扩增一段DNA序列，所谓分离，所谓扩增，方法有很多，应用广泛的就是。 * 用一对分别与两条单链DNA的3‘末端的寡核苷酸片段为引物， 利用生物体内DNA复制的原理在生物体外（离心管）进行扩增， * PCR技术的主要用途 1、目的基因的克隆：