纳豆激酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达.pdf

! #$ 年$ 月 重庆师范大学学报（自然科学版） %’( #$ 第) 卷 第$ 期 %*+,’- *. /0*’123’1 4*,5- 6’378,93:;（4:+,- =38’=8 ） *-( ) 4*( $ ?@A ：/4BA ：C#D $$ECF 4( #$#$$C( $G#) ( #$H 纳豆激酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达! 李! 莹，陈! 斌，敬俊锋，何正波 （重庆师范大学 昆虫与分子生物学研究所 重庆高校生物活性物质工程研究中心 活性物质生物技术教育部工程研究中心，重庆H###HI ） 摘要：纳豆激酶是一种良好的天然蛋白酶类溶栓物质。国内外许多学者对该酶进行了基因工程研究，但在克隆表达 过程中出现了许多长短不同的基因片段。本研究通过原产日本的优质纳豆中分离鉴定出高产纳豆杆菌4#I 并提取 该菌株的全基因组；通过J/K 手段扩增出能编码纳豆激酶信号肽，前导肽和成熟肽的前纳豆激酶酶原基因!$，以 及能编码纳豆激酶成熟肽的纳豆激酶基因! ，构建了纳豆激酶基因的表达载体LMNO#D4B$ 和LMNO#D4B ，转化 #$ %’( PQ$ 后在大肠杆菌中表达，并进行了活性分析。结果发现，纳豆激酶酶原基因片段!$ 能成功表达出有活 性的分泌型纳豆激酶；而纳豆激酶基因片段! 的表达产物为无活性的包涵体。在对!$ 和! 的比较研究后可 知，纳豆激酶酶原基因片段!$ 能在大肠杆菌中很好的分泌表达，这将为纳豆激酶基因工程的深入研究奠定基础。 关键词：纳豆激酶基因；大肠杆菌；克隆；表达 中图分类号： RIGC ；RIGE 文献标志码：S! ! ! 文章编号：$EID EE)O（#$ ）#$D ##IID #C ! ! 纳豆激酶是纳豆在发酵过程中由纳豆杆菌分泌 豆激酶的分子结构，进一步降低分子量、提高酶活力 ［$］ 和热稳定性、延长半衰期等奠定基础。 的一种可溶解血栓的蛋白质 ，它不仅能直接作用 于纤维蛋白，而且还可以激活体内的:DJS ，从而表现 ［ ］ $ 材料与方法 出很强的溶血栓作用 。此外，它还具半衰期长、无 毒副作用、分子量小、可以口服、口服后无不良反应 $( $ 材料 等优点［O ］。因此国内外有关研究人员都认为它极有 $( $( $ 载体与菌株! 纳豆杆菌4#I 由本实验室从纳 可能成为新一代的抗血栓药物［H ］。 豆中筛选获得；用于转化的菌株为#$ %’( PQ$；LYD ［C ］ 4T5+, 等 首次报道了包括调控顺序在内 ?-GDN 35L-8 载体为大连 NBK 公司产品；LMND 的$ HIO UL 的! 全长基因序列。! 基因以VNV O# 载体本实验室保存。 为起始密码子，随后是$ $HO UL 组成的阅读框架，4 $( $( 工具酶与试剂! 溶菌酶、MZN2 酶、限制性内 端的第$ W ) 个氨基酸残基是信号肽（31’- L8LD 切酶P5[ A 、Z0* A 、NH ?4S-3198 和?4S Y,T8, 均 :3X8 ），第 O# W $#E 的 II 个氨基酸残基是前肽 购自大连NBK 公司；64ARD$# 柱式?4S 胶回收 （J,*L8L:3X8 ），随后的IC 个氨基酸残基为纳豆激酶 试剂盒、细菌总?4S 提取试剂盒、小量质粒抽提试 成熟肽（4::*T3’98 ）。利用基因工程技术，作为药 剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司；凝 物大规模生产稳定高效具有导向性的溶栓药物纳豆 血酶、纤维蛋白原、尿激酶购自北京鼎国生物技术有 激酶对于提高疗效、安全性及延长药物的半衰期，降 限责任公司；其它试剂均为国产或进口分析纯。 低生产