真核基因在大肠杆菌中的表达 (2).ppt

T7噬菌体启动子：它是来自T7噬菌体的启动子，具有高度的特异性。只有T7RNA聚合酶才能使其启动，故可以使克隆化基因独自得到表达。T7RNA聚合酶的效率比大肠杆菌RNA聚合酶高5倍左右第28页，共76页，星期日，2025年，2月5日第29页，共76页，星期日，2025年，2月5日第三节真核基因在大肠杆菌中的表达第30页，共76页，星期日，2025年，2月5日1.外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位细胞质中表达：易形成包涵体包涵体：由不可溶性蛋白聚集折叠形成，是外源基因高效表达时常发生的一种特殊生理现象。包涵体形成的理化参数：电荷的平均数、形成转角的氨基酸残基的组分、半胱氨酸的组分、脯氨酸的组分、亲水性和氨基酸残基的总数。第31页，共76页，星期日，2025年，2月5日表达蛋白形成包涵体的优缺点：优点：易于分离蛋白被保护而免受胞内酶的降解蛋白质没有活性，不会对寄主细胞造成伤害缺点：很难恢复生物学活性蛋白质的终产量低第32页，共76页，星期日，2025年，2月5日解决方案：限制包涵体的形成⑴外源基因与分子伴侣共表达分子伴侣：能够阻止聚合作用而使蛋白质正确折叠。⑵使用硫氧还蛋白缺陷的寄主菌株目的：维持有利的氧化还原电位⑶低温诱导，降低蛋白质的合成速率⑷与高可溶性的多肽融合表达第33页，共76页，星期日，2025年，2月5日第34页，共76页，星期日，2025年，2月5日第35页，共76页，星期日，2025年，2月5日第36页，共76页，星期日，2025年，2月5日1.稀释复性：直接加入水或缓冲液，放置过夜，缺点是体积增加较大，变性剂稀释速度太快，不易控制。稀释法主要有一次稀释、分段稀释和连续稀释三种方式。2.透析复性：好处是不增加体积，通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度，但可能形成无活性蛋白质聚体，且不适合大规模操作，无法应用到生产规模。3.超滤复性：在生产中较多的使用，规模较大，易于对透析速度进行控制，缺点是不适合样品量较少的情况，且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性。包涵体蛋白复性方法第37页，共76页，星期日，2025年，2月5日4.柱上复性：是最近研究较多并成功的在生产中应用的一种复性方法，包涵体蛋白变性后，在色谱柱上复性，大致可分成疏水柱复性及凝胶柱复性两类。其中的凝胶柱复性均是用Sephacry1S-100或Superdex75等分子筛填料，柱较长（40cm-100cm不等）。相比稀释和透析两种方法，色谱柱复性回收率高（高达90%以上）、快速、易放大，样品稀释倍数小（一般五倍左右）第38页，共76页，星期日，2025年，2月5日5.高蛋白质浓度下的复性：通常有两种方法，一是缓慢地连续或不连续地将变性蛋白加入到复性缓冲液中，使得蛋白质在加入过程中或加入阶段之间有足够的时间进行折叠复性；二是采用温度跳跃式复性，即让蛋白质先在低温下折叠复性以减少蛋白质聚集的形成，当形成聚集体的中间体已经减少时，迅速提高温度以促进蛋白质折叠复性。第39页，共76页，星期日，2025年，2月5日6.添加促进剂的复性方法：包涵体蛋白质折叠复性促进剂的促进作用可以分为：稳定正确折叠蛋白质的天然结构、改变错误折叠蛋白质的稳定性、增加折叠复性中间体的溶解性、增加非折叠蛋白质的溶解性。a、共溶剂：如PEG6000~20000、甘油等b、去污剂及表面活性剂：如TritionX-100、CHAPs等C、氧化-还原剂：对于含有二硫键的蛋白，复性过程中应加入氧化还原体系，如GSH/GSSG等d、0.4~0.6ML-Arg：L-Arg能使得不正确折叠的蛋白质结构以及不正确连接的二硫键变得不稳定，使折叠向正确方向进行，可大幅度地提高包涵体蛋白质的折叠效率e、分子伴侣和折叠酶第40页，共76页，星期日，2025年，2月5日周质中表达优点：周质中细胞蛋白少，有利于外源蛋白的纯化。周质中的氧化环境有利于蛋白质的正确折叠。周质中蛋白质的降解作用小。条件：需要信号肽的引导，使表达蛋白由细胞内膜转运到周质。第41页，共76页，星期日，2025年，2月5日蛋白转运过程相当复杂蛋白质跨膜过程还与细胞的结构特征有关。即使存在信号肽，也不能保证蛋白正确转运到周质中。如：免疫球蛋白与T-细胞受体分子结构相似。免疫球蛋白可以在周质中表达。T-细胞受