真核基因在大肠杆菌中的表达.ppt

质粒拷贝数质粒拷贝数对细菌生长代谢的影响目前实验室里广泛使用的表达型质粒在每个大肠杆菌细胞中可达数百甚至上千个拷贝，质粒的扩增过程通常发生在受体细胞的对数生长期内，而此时正是细菌生理代谢最旺盛的阶段。质粒分子的过度增殖以及其后目的基因的高效表达势必会影响受体细胞的生长代谢，进而导致重组质粒的不稳定性以及目的基因宏观表达水平的下降解决上述难题的一种有效策略是将重组质粒的扩增纳入可控制的轨道第95页,共110页，2024年2月25日，星期天质粒扩增时序的控制pCP33拥有一个温度可诱导型的复制子在28℃时，每个细胞的质粒拷贝数为60在4422℃时，拷贝数迅速增至300-600在此温度下，受体细胞染色体上的CI基因表达的温度敏感型阻遏蛋白失活因此，用一种手段同时控制质粒拷贝数和基因的表达第96页,共110页，2024年2月25日，星期天3.mRNA转录本的分子特性对基因表达效率的影响a.转译起始序列对表达效率的影响b.mRNA的稳定性对表达效率的影响第97页,共110页，2024年2月25日，星期天核糖体结合位点对外源基因表达的影响SD序列的影响：一般来说，mRNA与核糖体的结合程度越强，翻译的起始效率就越高，而这种结合程度主要取决于SD序列与16SrRNA的碱基互补性，其中以GGAG四个碱基序列尤为重要。对多数基因而言，上述四个碱基中任何一个换成C或T，均会导致翻译效率大幅度降低第98页,共110页，2024年2月25日，星期天SD序列下游的碱基若为AAAA或UUUU，翻译效率最高；而CCCC或GGGG的翻译效率则分别是最高值的50%和25%。紧邻AUG的前三个碱基成份对翻译起始也有影响，对于大肠杆菌β-半乳糖苷酶的mRNA而言，在这个位置上最佳的碱基组合是UAU或CUU，如果用UUC、UCA或AGG取代之，则酶的表达水平低20倍SD序列与起始密码子之间的序列的影响：第99页,共110页，2024年2月25日，星期天SD序列与起始密码子之间的距离的影响：SD序列与起始密码子之间的精确距离保证了RNA在核糖体上定位后，翻译起始密码子AUG正好处于核糖体复合物结构中的P位，这是翻译启动的前提条件。在很多情况下，SD序列位于AUG之前大约七个碱基处，在此间隔中少一个碱基或多一个碱基，均会导致翻译起始效率不同程度的降低第100页,共110页，2024年2月25日，星期天起始密码子及其后续若干密码子的影响大肠杆菌中的起始tRNA分子可以同时识别AUG、GUG和UUG三种起始密码子，但其识别频率并不相同，通常GUG为AUG的50%而UUG只及AUG的25%。除此之外，从AUG开始的前几个密码子碱基序列也至关重要，至少这一序列不能与mRNA的5’端非编码区形成茎环结构，否则便会严重干扰mRNA在核糖体上的准确定位目前广泛用于外源基因表达的大肠杆菌表达型质粒上，均含有与启动子来源相同的核糖体结合位点序列，序列和间隔是最佳的第101页,共110页，2024年2月25日，星期天4.遗传密码子的使用对基因表达效率的影响a.密码子使用的偏爱性现象的规律性?几乎在所有的简并密码子家族中，都有一个或两个是优先使用的偏爱性密码子；?一些密码子在各种不同基因中都是最常用的（在编码脯氨酸4种同义密码子，CCC是优先使用的）?高表达活性的基因比低表达活性的基因，呈现出较高程度的密码子偏爱性?简并密码子的使用频率，反应它们相应的tRNA丰度。第102页,共110页，2024年2月25日，星期天b.密码子使用偏爱性对基因表达效率的影响富含大肠杆菌罕用密码子的外源真核基因，很难在大肠杆菌转化子细胞中得到有效的表达。不同生物密码子的偏爱性，是阻碍外源基因在大肠杆菌中高效表达的一种重要因素。第103页,共110页，2024年2月25日，星期天生物体对密码子的偏爱性不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并密码子使用频率并不相同，具有一定的偏爱性，其决定因素是：第104页,共110页，2024年2月25日，星期天生物基因组中的碱基含量在富含ATT的生物（如单链DNA噬菌体φX174）基因组中，密码子第三位上的U和A出现的频率较高；而在GC丰富的生物（如链霉菌）基因组中，第三位上含有G或C的简并密码子占90%以上的绝对优势密码子与反密码子相互作用的自由能性中等强度规律细胞内tRNA的含量如GGG、CCC、GCG、GGC、AAA、UUU、AUA、UAU等使用少；如GUG、CAC、UCG、AGC、ACA、UG