真核基因在大肠杆菌中的表达.ppt

Trp启动子表达载体已用来生产了α-干扰素和γ-干扰素三启动子串联单元表达效率高于单启动子单元第55页，共110页，星期日，2025年，2月5日3.PL启动子的表达载体是一种最广泛使用大肠杆菌表达载体的启动子之一。第56页，共110页，星期日，2025年，2月5日λ噬菌体的阻遏物－操作系统第57页，共110页，星期日，2025年，2月5日cI基因存在一个温度敏感突变等位基因。42度时，阻遏蛋白失活；28-30度时，PL启动子完全被阻遏蛋白抑制通过改变温度来控制PL启动子的开闭第58页，共110页，星期日，2025年，2月5日pPLc24表达载体：用来表达天然的蛋白质和融合的蛋白质。这个质粒表达载体含有MS2-聚合酶基因开始的98个密码子，不具有转译起始密码子的外源片断也能实现表达。在MS2-聚合酶基因下游，存在BamH?和Hind?单切点。EcoR?单切点靠近λPL启动子，处于转译起始密码子之前。第59页，共110页，星期日，2025年，2月5日第60页，共110页，星期日，2025年，2月5日pPLa2311表达载体可以控制具有转译起始区的外源片断插入基因的表达。这种启动子可接受热敏感的λ阻遏蛋白质的抑制。第61页，共110页，星期日，2025年，2月5日组成：1.pBR322的Hae?－EcoR片断；编码ampr2.λ噬菌体的Hae?-Hae?片断：λPL3.pMK20质粒的Hae?片断：编码kanr4.具有ColE1复制起点的Hae?片断：经pMK20质粒转移而来。第62页，共110页，星期日，2025年，2月5日第63页，共110页，星期日，2025年，2月5日pPLc2833表达载体调节型强启动子：能够使克隆的真核基因在大肠杆菌寄主细胞中最有效的高水平表达第64页，共110页，星期日，2025年，2月5日组成：1.一个调节型的强启动子；2.一个用作选择记号的氨苄青霉素抗性基因ampr；3.一个直接位于PL启动子下游的多克隆位点（MCS）区第65页，共110页，星期日，2025年，2月5日若由pKN402质粒的DNA复制起点取代pPLc2833质粒的DNA复制起点，由此形成的新质粒pCP3。它在大肠杆菌寄主细胞中指导外源蛋白质合成的有效性可得到有效的提高。而且这种质粒是温度敏感型的载体。（42度，拷贝数提高5～10倍）go第66页，共110页，星期日，2025年，2月5日克隆的真核基因在大肠杆菌细胞中的表达第67页，共110页，星期日，2025年，2月5日外源蛋白质在大肠杆菌细胞中的表达部位融合蛋白质的表达第68页，共110页，星期日，2025年，2月5日1.细胞质中表达2.周质中表达3.胞外表达1.外源蛋白质在大肠杆菌细胞中的表达部位第69页，共110页，星期日，2025年，2月5日细胞质中表达:外源基因在大肠杆菌寄主细胞质中高效表达时，常会发生一种特殊的生理现象，形成包涵体（InclusionBodies，IB）包涵体：存在于细胞质中的一种由不可溶性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构物。影响其形成的关键因素：电荷的平均数、形成转角的氨基酸残基组分第70页，共110页，星期日，2025年，2月5日优点：1.形成包涵体a.蛋白质易于以高纯度和高浓度方式分离b.蛋白质受保护而免受胞内酶的降解作用c.蛋白质没有活性，因此不会使寄主细胞受伤害第71页，共110页，星期日，2025年，2月5日2.蛋白质的产量高二硫键的断裂以及转译修饰作用的丧失，会导致外源片断编码的蛋白质在大肠杆菌中超量表达。3.表达的质粒载体构建比较简单。第72页，共110页，星期日，2025年，2月5日缺点：1.包涵体a.蛋白质折叠了，再折叠的蛋白质可能无法恢复其生物学活性b.蛋白质的终产量偏低c.蛋白质的生产成本比较昂贵2.还原的环境不利于二硫键的形成（硫氧还蛋白系统、谷氧还蛋白系统）第73页，共110页，星期日，2025年，2月5日3.由于N－末端存在甲硫氨酸。使蛋白质的真实性受影响4.蛋白质会被酶解5.蛋白质种类多，因此纯化比较复杂第74页，共110页，星期日，2025年，2月5日周质中表达：周质：在大肠杆菌一类格兰氏阴性菌中，位于内