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第八章 大肠杆菌基因表达系统 克隆基因的表达： 一、原核表达系统的注意事项 乳糖启动子lac 色氨酸启动子trp cI857: 三、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位 2. 周质中表达 （3）常用的原核信号肽 （2）真核信号肽 3. 胞外表达 四、几种类型的原核表达载体 pKK223-3 载体 2. 分泌型表达载体 pIN III-comA1 3. 融合蛋白表达载体系统----pGEX系列 （3）产物提纯 （4）产物分离 pGEX （5）其他融合蛋白系统 （2）-35区与-10区之间的距离 2. 翻译起始序列对表达效率的影响 （2）起始密码AUG 4. 转录终止区对表达效率的影响 六、提高表达水平常用的方法 ?PL启动子是温度诱导型 tac启动子是药物诱导型 （2）表达载体诱导复制 （1）设计成融合蛋白 （2） 使用突变菌株，保护外源蛋白不被降解 （3）表达分泌蛋白 细菌蛋白分泌的条件： AUG左侧的三个碱基也有影响。 ?-半乳糖苷酶的mRNA中： AUG左侧如果是UAU或CUU时，最为有效； 如果是UUC、UCA或AGG时下降20倍。 3. 启动子与外源基因之间的距离 3. 启动子与外源基因之间的距离 5.载体拷贝数及稳定性对表达效率的影响 6.外源蛋白在菌体中的稳定性对表达效率的影响 选择强启动子序列，如tac 等 2. 调整S-D序列与AUG间的距离 3. 改变起始密码下面的几组密码子 一般为5-9bp。 能提高翻译的起始效率。 4. 增加mRNA的拷贝数和稳定性 “重复性基因外回文序列”能防止mRNA受到3’?5’外切酶的攻击。 5. 减轻宿主细胞的代谢负荷 合理地调节代谢负荷与外源基因高效表达的关系。 将宿主生长代谢与外源基因表达分开。 （1）诱导表达 一般采用温度诱导或药物诱导。 cI857阻遏物有活性，抑制?PL启动子，外源基因不表达，宿主大量生长。 32°C: 42°C: cI857阻遏物失活，PL启动子启动，外源基因高水平表达，宿主生长受到限制。 cI857 PL 外源基因 PO 调节基因lac I（位于宿主基因组内或载体上）始终产生阻遏物。 无IPTG: 阻遏物与lac操纵基因结合，抑制外源基因转录。宿主大量生长。 有IPTG: 阻遏物与IPTG结合，lac操纵基因解放，外源基因大量转录。宿主生长受抑制。 将宿主的生长与载体的复制分开。 当宿主大量生长后，再诱导载体质粒的复制，增加拷贝数。 当需要宿主大量生长时，抑制载体质粒的复制。 N末端：由原核基因编码一段多肽， C末端：是完整的真核外源基因。 质粒基因产物 目的基因产物 N C 切割 6. 提高表达产物的稳定性 防止被宿主的酶降解。 ①使用lon-菌株，减少宿主菌的蛋白酶合成。 ② T4噬菌体的pin基因产物能抑制细菌的蛋白酶。可把pin增加到载体上。 减少宿主菌本身的蛋白酶的表达。 * * 外源基因在宿主细胞中表达。 外源基因 表达载体 重组载体 导入宿主细胞 在宿主细胞中 表达出蛋白质 提取蛋白 宿主细胞： 原核细胞或真核细胞。 外源基因不能带有内含子。 2. 必须用cDNA或者是化学合成的基因。 3. 不能直接用真核基因组DNA。 4. 必须利用原核细胞的调控原件（启动子等） 5. 防止外源基因产物对宿主细胞的毒害。 除了具备克隆载体具备的条件外，还应具备以下条件： 1.强启动子、强转录终止子 2.可诱导性 3.合适的核糖体结合位点和起始密码ATG等 二、理想原核表达载体具备的基本特征 A dividing E. coli 原核或噬菌体启动子 MCS SD序列 终止子 ① 必须是一种强启动子 ② 应呈现低水平的基础转录 ③应是可诱导型的 用温度或化学试剂诱导。 （1）最佳启动子必须具备的条件 基因工程常用的原核启动子 Plac O 目的基因 P1 O trpE 目的基因 噬菌体启动子是PL 42oC时阻遏蛋白失活，外源基因大量转录 cI857 PL 外源基因 28oC时阻遏PL，外源基因不转录。 1. 细胞质中表达 （1）包涵体（inclusion body） 是存在于细胞质中的一种不溶性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构物。 形成原理未知。 使重组蛋白易于分离、免受蛋白酶降解、不损害寄主细胞 回收的蛋白生物活性差。 ② 缺点 ① 优点 （1）周质（periplasm） 格兰氏阴性大肠杆菌位于内膜和外膜之间的细胞结构部分。 优点： 容易被浓缩和纯化、有利于正确折叠、被降解的少。 phoA、OmpA、OmpT、OmpF、LamB、β-内酰胺酶（lactamase） ①大肠杆菌的信号肽： 能带领蛋白穿过膜到达周质。但以后需要正确切割掉。 （2）信号肽（signal peptide） 一般位于N端。 ②金黄色葡萄球菌的蛋白A。 鼠源RN