大肠杆菌表达系统.pdf

活性蛋白整体方案 Active Protein Solutions 大肠杆菌表达系统 大肠杆菌蛋白表达原理 诱导原理 ：Lac 阻遏物是一种具有 4 个相同亚基的四级结构蛋白 ，都有一个与诱导剂结合的位点。在没有乳糖存在 时 ，lac操纵子 （元 ）处于阻遏状态 ，Lac 阻遏物能与操纵基因O结合 ，阻碍 RNA 聚合酶与 P序列结合 ，抑制转 录起动。而当有诱导剂与阻遏蛋白结合后 ，其蛋白构象就发生变化 ，导致阻遏物从操纵基因O上解离下来 ，RNA 聚合酶不再受阻碍 ，发生转录。详情见 IPTG诱导蛋白表达的原理 大肠杆菌表达系统步骤 不包括基因构建等上游操作和蛋白纯化部分。基因构建参考密码子优化 ，蛋白纯化参考蛋白纯化专题。以下内容主 要包括蛋白表达鉴定 ： 1. 表达鉴定第一天的任务 ，常用抗性选择根据感受态细胞选择  拿到质粒 ，离心 （3000r/min ；2min ）  在质粒中加入 TE （使质粒最终加入到 110μL感受态细胞中的量为 80-100ng ，据此确定加入 TE的量  一般为 （1μg质粒加 20μLTE ；2μg质粒加 50μLTE ；5μg质粒加 100μLTE ）  将质粒与 TE混匀 ，加入 2μL混液于感受态细胞中  将感受态细胞放入冰箱 （4℃ ）中 ，30min  取出后立即放入水浴锅中 （42℃ ），热激 90s ，  再次放入冰箱 （4℃ ）中 ，3min  拿出后取 200μL的 LB液体培养基加入到已转入质粒的感受态细胞中  放入摇床 （37℃ ； 195r ）中 ， 30nim至 60min ； （最佳 45min ）  取出离心 （3000r/min ；2min ）  去掉 200μL的上清 ，留 100μL左右上清悬浮沉淀 ，吸取 50μL悬液涂平板 ，（先将对应抗性的平板放入培 养箱 （37℃ ）中预热 20min ）  把平板放入培养箱 （37℃ ），过夜 （12h至 16h ） 2. 表达鉴定第二天的任务 ，注意 Pcold 的表达温度  每个平板挑取单菌落至 4 支对应抗性的 LB （4ml ）试管中 ，编号为 “0” “1” “2” “3” Tel: 025 5889-4959 www DetaiBio com Order@DetaiBio com （ ） 。 。 。 活性蛋白整体方案 Active Protein Solutions  将试管放入摇床 （37℃ ；195r ）中 ，（单抗 3h左右 ；双抗 4 左右 ；刚开始用可见分光光度计测 OD值 ； 熟练后可目测 （背光下 ，以试管中的枪头为例 ，刚刚看不见枪头即可 ）），测 OD值 （0.6至 0.8 ）  从 “0”号管中取 700μL悬液加入到 100μL （C=80% ）的保种甘油中 ，震匀 ，放入冰箱 （-20℃ ）冻存  在每组菌的 “1” “2” “3”号试管中分别加入 2μL的 IPTG （终浓度 0.5mM最适 ）  视不同的载体选择适合的表达环境 （PET/PGEX ：15℃表达过夜 ；25℃表达 6h ；37℃表达 3h至 4h （4 支 试管 ， “0” “1”号试管 15℃表达过夜 ；“2” “3”试管 37℃表达 3h至 4h ）。Pcold ：全部 15℃表达 过夜 ） 3. 表达鉴定第三天 ，全菌的表达鉴定分析 ，注意控制溶质的量及溶液黏度  从每组 4 支的试管中均取 500μL菌液加入到 1.5ml离心管中 ，（若 OD值不一样 ，值小的可多取 ）离心 （6000r/min ），5