基因在大肠杆菌酵母中的高效的表达.ppt

关于基因在大肠杆菌酵母中的高效的表达第1页，共33页，星期日，2025年，2月5日前言基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。基因工程主要目标之一是生产常规方法难以生产的大量蛋白质产物—即实现基因的高效表达。基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得原生物活性又可高产的表达产物。第2页，共33页，星期日，2025年，2月5日最佳的基因表达体系：⑴目的基因的表达产量高;⑵表达产物稳定;⑶生物活性高;⑷表达产物容易分离纯化。第一节基因的表达系统与表达策略第3页，共33页，星期日，2025年，2月5日宿主细胞的选择一、适合目的基因表达的宿主细胞的要求:1、容易获得较高浓度的细胞；2、能利用易得廉价原料；3、不致病、不产生内毒素；4、发热量低、需氧低、适当的发酵温度和细胞形态；5、容易进行代谢调控；6、容易进行DNA重组技术操作；7、产物的产量、产率高，8、产物容易提取纯化。第4页，共33页，星期日，2025年，2月5日二、宿主细胞分为两大类：1、原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等；2、真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。第5页，共33页，星期日，2025年，2月5日大肠杆菌目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表达体系。优越性：①对大肠杆菌的基础生物学、分子遗传学等背景知识和基因表达的调控机理已有了深刻了解。②有各类菌株和载体系列。③目前以实现多种基因的高效表达。表达基因产物形式多样:细胞内不溶性表达(包含体)、细胞内可溶性表达、细胞周质表达等。④易培养，成本低。第6页，共33页，星期日，2025年，2月5日缺点：①大肠杆菌中的表达不存在信号肽，产品多为胞内产物，提取困难。②因分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体，表达产物需经变性复性才恢复活性。③蛋白质不能糖基化。产物蛋白质N端多余一个蛋氨酸残基。④其内毒素很难除去。第7页，共33页，星期日，2025年，2月5日酵母酵母菌是研究基因表达最有效的单细胞真核微生物。其基因组小，世代时间短，有单倍体双倍体两种形式，繁殖迅速，无毒性。能外分泌，产物可糖基化。已有不少真核基因成功表达。第8页，共33页，星期日，2025年，2月5日基因表达的基本过程第9页，共33页，星期日，2025年，2月5日基因表达的基本过程基因的表达主要涉及到两个过程：转录和翻译。首先，目的基因通过转录(transcription)形成mRNA（信使RNA,messengerRNA)；然后，tRNA（转运RNA,transferRNA）将各种氨基酸运送到核糖体并按照mRNA的密码子顺序将各种氨基酸连接成特定的氨基酸序列(translation)最终得到基因的表达产物（蛋白质）。第10页，共33页，星期日，2025年，2月5日Transcription(转录):makinganRNAcopyofaDNAsequence.RNApolymeraseopensthepartoftheDNAtobetranscribed.OnlyonestrandofDNA(thetemplatestrand,antisensestrand)istranscribed.转录的具体过程第11页，共33页，星期日，2025年，2月5日启动子（promoter）：在基因序列中，标志着转录起始的可被RNA聚合酶识别的位点(DNA区段)，一般位于基因的上游。终止子（terminator）：位于基因的编码序列之外（一般在下游）的一段标志着转录停止的RNA聚合酶识别位点。有效转录的基本条件第12页，共33页，星期日，2025年，2月5日正确翻译的基本条件1、具备起始密码子2、具备终止密码子3、具有正确的阅读框第13页，共33页，星期日，2025年，2月5日基因表达的基本过程第14页，共33页，星期日，2025年，2月5日根据表达蛋白用途选择基因的表达策略一、生物化学和分子生物学研究二、表达蛋白质用作抗原三、结构研究第15页，共33页，星期日，2025年，2月5日真核基因表达的特点一条成熟的mRNA只能翻译成一条多肽，不存在象原核生物那样的多基因操纵子模式；基因转录调节区很大，而且往往远离启动子达几百个甚至上千个碱基，它们并不直接影响RNA聚合酶与启动子区的结合，而是通过改变基因5