人甲状旁腺激素-血清白蛋白融合蛋白的构建及在毕赤酵母中的表达.pdf

中国生物工程杂志ChinaBiotechnolog)，，2007，27(2)：14—18 人甲状旁腺激素-血清白蛋白融合蛋白的 构建及在毕赤酵母中的表达 王 俊 沈 微饶志明 诸葛健4 (江南大学工业微生物技术教育部重点实验室无锡214036) 序后插入表达载体pPIc9K中，在启动子AOxI和仅交配因子信号肽的作用下，分泌表达融合蛋 白肼H．HSA。重组质粒pPIC9K／胛H—HSA经ZI线性化后，电击转化毕赤酵母KM71，经G418 筛选得到的转化子。PcR鉴定后，用甲醇诱导表达，蛋白电泳分析表明融合基因得到表达； westem 定发酵上清中融合蛋白的甲状旁腺激素活性为318Iu／ml。 关键词人甲状旁腺激素 融合蛋白 表达载体pPIc9K毕赤酵母 中图分类号Q786 甲状旁腺激素是人体内重要的钙磷调节因子，最 长其半衰期。本研究是利用基因工程手段将甲状旁腺 初合成产物是115个氨基酸残基的前甲状旁腺激素原 激素与人血清白蛋白融合，并且中间无任何连接肽。 (preproh阴H)，在分泌过程中切除N端31个氨基酸残本研究利用巴斯德毕赤酵母表达系统，以分泌型 基形成成熟的84个氨基酸的多肽激素。hPTH的生理 功能主要是刺激肾对钙的重吸收、磷的分泌和骨的重 过这一载体将拼接后的PTH．HsA基因整合到酵母染 建，导致合成和分解作用。临床上如果hPTH的分泌量色体中，筛选得到高拷贝遗传稳定的重组子，并分泌表 过高，血中hPTH浓度异常，会导致甲旁亢，从而引起骨达了融合蛋白PTH-HSA。 的脱矿质化。hPTH还可通过细胞膜钙通道对心血管 1材料与方法 产生作用。研究表明h阴H的活性中心位于N端1～ 34氨基酸肽段，它通过与肾骨组织中专一性受体相结 1．1材料 合而发挥作用…。hwH分子不含半胱氨酸，在体内很 1．1．1 菌株及质粒 不稳定【2|，且含量很低给分离纯化带来困难。 明H通过与受体结合后激活腺苷酸环化酶和蛋白 杆菌JMl09(本实验室保藏)；puCl9 激酶c的活性，改变骨吸收和骨合成的速率，影响骨代 谢如果盯H的活性片段在较低或中等剂量的浓度下长 时间作用于骨，则会刺激骨的形成，并且通过诱导骨中 藏)。 的合成作用而有效地治疗骨质疏松症【3，4I。由于胛H1．1．2主要试剂和工具酶质粒小量抽提试剂盒、 分子量较小，易被肾小球滤过，因而在体内的半衰期较 DNA胶回收试剂盒(上海博大泰克)；环磷酸腺苷 短，皮下给药或肌肉注射的半衰期一般在12h左右。 为了达到治疗效果，一般需要频繁大剂量用药，为了克 (TaKaRa公司)；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、广范围蛋 服上述缺点，人们通过对甲状旁腺激素加以修饰，以延 白质分子量标准(Pmmega公司)；酵母抽提物、蛋白胨、 收稿日期：2006一11-01修回日期：2006—12—14 酵母氮基YNB均购自上海生工生物工程服务有限公 $通讯作者，电子信箱：jzhuge@sohu．eom 司，尿微量白蛋白检测试剂盒(上海名典生物公司)，其 万方数据 2007，27(2)王俊等：人甲状旁腺激素血清白蛋白融合蛋白的构建及在毕赤酵母中的表达 15 余试剂均为分析纯试剂。 1．2方法 1．2．1 重叠PCR拼 萄糖，1．5％琼脂)上，30℃培养1～2天至菌落出现。 胛H-HSA融合蛋白基因的构建 每块平板上挑单菌落并在含有0．2mg／ml、0．5mg／m1、 接胛H和HsA基因的大概流程如图l。以Ppthl和 Pptll2为引物，利用PCR从pMD胛H中扩增出胛H基 因(下游末端含有部分HsA序列)；以Phsa3和Phsa4 化子。 为引物，利用PCR从pBlue—HSA中扩增出HsA基因。