《医学细胞生物学》本科课件02章 细胞生物学的研究方法.ppt

1. 速度沉降（velocity sedimentation） 方法：在离心管中制备由顶部到底部逐渐增加的蔗糖溶液密度梯度(通常5%～20%)。 分离对象：密度相近而大小（沉降系数）不同的颗粒。 2. 平衡沉降（equilibrium sedimentation） 方法：在离心管中制备由顶部到底部高浓度差的蔗糖或氯化铯溶液密度梯度。 分离对象：密度不同颗粒。但由于离心时间长，一般不适合分离细胞。 后两者都是蛋白变性剂。 * * * 超过以上的放大倍数不能提高分辨率，属于无效放大。 70%细胞重量是水，多数内含物都是透光的，因此不经过处理的细胞在普通光镜下几乎看不见。需要染色观察。之前则需要固定处理，包埋切片（1-10um厚度）。染色苏木素染核酸，伊红染细胞质。——HE染色。 ⑴ 固定（fixation） 使大分子交联而保持在原有的位置上，防止结构移位或信息丢失。 常用的固定剂：戊二醛、甲醛 ⑵ 包埋（embedding） 使组织形成硬块，便于切片。 常用的包埋剂：石蜡、树脂 ⑶ 切片（section） 切片厚度为1～10?m。 ⑷ 染色（staining） 增大反差。 * 正常皮肤石蜡切片：HE染色。皮肤组织无收缩、上皮与真皮无分离、结构清晰（100X） * 波长较小，紫外线400nm 不同的荧光染料染色后——在紫外线激发光照射下，可以产生不同颜色的发射光（波长更长）。 荧光显微镜可以呈现强反差的彩色图像 * 目前常用于标记抗体的荧光素有以下几种：异硫氰酸荧光素，四乙基罗丹明，四甲基异硫氰酸罗丹明 3.应用 成像反差强，检测灵敏度高。 定性、定位和定量的研究组织内的荧光标记物质。 对活细胞内分子的动态变化进行实时观察。 * 通过变焦可以完成逐点/逐面扫描——光学切片！ 图像可以经过计算机重建得到完整三维图像。 （进行连续的光学切片，通过电脑进行三维重建。 ） * * * * 用于观察超微结构（ultrastructure），即小于0.2μm、光学显微镜下无法看清的结构，又称亚显微结构（submicroscopic structures）。 切片：电子的穿透力有限，需制作超薄切片，厚度通常为50~100nm。 染色：生物分子散射电子能力弱，需通过重金属染色，增大反差，常用锇、铀、铅等重金属的盐类。 * * 光学显微镜、TEM、SEM成像原理比较 * 细胞分离需根据不同细胞的特征采用不同的方法 * 形态与功能相结合是细胞生物学研究的突出特点，显示细胞内大分子、小分子甚至是无机离子在细胞内分布的分子示踪技术对细胞生物学的研究尤为重要。 一、酶细胞化学技术 (enzyme cytochemistry) 通过酶对特异底物的反应并显色来检测酶在器官、组织和细胞内的分布及酶活性强弱的一种技术。 原理：酶与底物结合。 检测方法：光度计、光镜、电镜等 。 二、免疫细胞化学技术 标记方法： 荧光染料标记抗体。 胶体金标记抗体。 酶标记抗体 。 反应方式： 直接反应——标记物标记一级抗体。 间接反应——标记物标记二级抗体，可增加信号强度。 * * 活细胞内分子示踪技术有应用到离子探针和蛋白探针—— * * 荧光实时定量PCR技术是检测基因表达变化的 常规方法 PCR特点：（1）特异性强，灵敏度高，快速稳定；（2）微量的模板DNA即可扩增大量产物。 常应用于：（1）基因组DNA分析以及（2）遗传病的诊断。 缺点主要体现在：（1）需靶DNA序列的信息和（2）有时易出现假阳性（太灵敏了）。 荧光实时定量PCR反应（quantitative PCR，qPCR）：在PCR反应体系中加入荧光染料，在每次反应循环后，检测反应管中的荧光强度。以反应管中荧光强度达到阈值时所需的PCR反应循环个数（Cp值），表示模板中目的片段的初始含量。 * 相差显微镜通常被用于观察活细胞 照明与目镜颠倒，便于观察贴壁生长细胞。 * 无需染色，适合活细胞观察。细胞培养实验常用。 暗视野显微镜通过散射光成像， 只看轮廓，看不清内部结构。 * 流式细胞术的分析和分选都依赖细胞的荧光信号，因此也被称为“荧光素激活的细胞分选技术” 分离对象：体积、质量差别较大的颗粒 。 * 一般由液流系统（细胞流动室）、激光发射系统、信号检测系统组成。 1、调节液压使细胞成单列，按重力方向流动； 2、被荧光抗体标记的细胞通过激光检测时，会发射一定强度荧光； 3、检测系统收集荧光信号，并转为电信号； 4、电场控制的细胞分选。 分离速度：2万个细胞/s ，分离纯度：＞99%。 * 分别是机械损伤、早期凋亡、晚期凋亡和正常生长细胞。 AnnexinV/PI双染检测细胞凋亡 Annexin-V可以在钙离子存在的情况下，和细胞表面外翻的磷脂酰丝氨酸