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第三章 细胞生物学研究方法 ?细胞形态结构的观察方法 ?细胞组分的分析方法 ?细胞培养、细胞工程与显微操作技术 第一节 细胞形态结构的观察方法 ?光学显微镜技术（light microscopy） ?电子显微镜技术 (Electro microscopy) ?扫描遂道显微镜 (scanning tunneling microscope ) 一、光学显微镜技术（light microscopy ?普通复式光学显微镜技术 ?荧光显微镜技术（Fluorescence Microscopy） ?激光共焦扫描显微镜技术（Laser Confocal Microscopy） ?相差显微镜（phase-contrast microscope） ?微分干涉显微镜（differential-interference microscope） ?录像增差显微镜技术（video-enhance microscopy） 普通复式光学显微镜技术 分辨率（即分辨极限, D）是指区分开两个质点间的最小距离. 荧光显微镜技术（Fluorescence Microscopy） ?原理与应用 ?直接荧光标记技术 ?间接免疫荧光标记技术 ?在光镜水平用于特异蛋白质 等生物大分子的定性定位： 如绿色荧光蛋白(GFP)的应用 激光共聚焦扫描显微镜(LCSM) 激光共聚焦扫描显微镜用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像。 经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。调焦深度不一样时，能显示细胞样品的立体结构。图1 图2 暗视野显微镜 dark field microscope 聚光镜中央有挡光片，照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野背景是黑的，物体边缘是亮的。 可观察 4~200nm的微粒子，分辨率比普通显微镜高50倍。 相差显微镜 把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。 在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处: 环形光阑：位于光源与聚光器之间。 相位板：物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。 这种显微镜最大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞。 相差显微镜（phasecontrast microscope）由P．Zernike 于1932年发明，并因此获1953 年诺贝尔物理奖。 图 用途：观察未经染色的玻片标本 二、 电子显微镜技术 ?电子显微镜的基本知识 ?电镜与光镜的比较 ?电镜与光镜光路图比较 ?电子显微镜的基本构造 ?主要电镜制样技术 ?超薄切片技术 ?负染色技术 ?冰冻蚀刻技术 ?电镜三维重构技术 ?扫描电镜（Scanning electron microscope，SEM） 电镜与光镜光路图比较 电子显微镜的基本构造 主要电镜制样技术 ?超薄切片技术 用于电镜观察的样本制备 示意图 ?负染色技术（Negative staining）图 染色背景，衬托出样品的精细结构 ?冰冻蚀刻技术（Freeze etching） 技术示意图 冰冻断裂与蚀刻复型：主要用来观察膜断裂面 的蛋白质颗粒和膜表面结构。 ?电镜三维重构技术 电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合 而形成的具有重要应用前景的一门新技术。 电镜三维重构技术与X-射线晶体衍射技术及核磁共振分析技 术相结合，是当前结构生物学——主要研究生物大分子空间结 构及其相互关系的主要实验手段。 负染色技术 用重金属盐(如磷钨酸) 染色；吸去染料干燥后，样品凹陷处铺了一层重金属盐，而凸的出地方没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右。 扫描电镜（SEM） ?原理与应用： 扫描电子显微镜于20世纪60年代问世，用来观察标本的表面结构。工作原理是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与电子束入射角有关，也就是说与样品的表面结构有关，次级电子由探测体收集，并在那里被闪烁器转变为光信号，再经光电倍增管和放大器转变为电信号来控制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。图像为立体形象，反映了标本的表面结构。为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属微粒，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。 CO 2临界点干燥法防止引起样品变形的表面张力问题。