细胞生物学研究方法.ppt

人类精子（三）扫描隧道显微镜

scanningtunnelingmicroscope，STM01根据隧道效应设计，非破坏性测量。03三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察。02分辨率：横向为0.1~0.2nm，纵向可达0.01nm。highvoltageelectronmicroscope（四）高压电子显微镜1原子力显微镜atomicforcemicroscope加速电压高，用于观察较厚的生物组织三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察用于观察不导电的生物材料活细胞表面、生物大分子空间伸展2三、显微操作技术

micromanipulationtechnique是在倒置显微镜下利用显微操作器进行细胞或早期胚胎操作的一种方法。包括细胞核移植、显微注射、嵌合体技术、胚胎移植以及显微切割等。细胞核移植技术已有几十年的历史，1952年，Briggs和King等将不同阶段的蛙胚细胞核注入去核的蛙卵，构建核移植胚。Gordon（1962）证明原肠胚以后的细胞核移植能发育到成体。1997年，Wilmut等克隆了绵羊Dolly。显微操作仪转基因显微操作过程离心分离技术悬浮液中的颗粒的沉降速度与其质量、密度、体积相关，还与悬浮介质的密度和黏度相关。是分离细胞器及各种大分子基本手段。四、细胞的分离和分析技术1.差速离心法Differentialcentrifugation特点：介质密度均一；速度由低向高，逐级离心。用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。沉降顺序：核——线粒体——溶酶体与过氧化物酶体——内质网与高基体——核蛋白体。可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。01Lowspeed02Highspeed03Differentialcentrifugation2.移动区带离心法moving-zonecentrifugation用于体积差别较小的颗粒的分离制备有密度梯度的离心介质。介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。3.等密度离心法isodensitycentrifugation用途：分离密度不等的颗粒。特点：介质密度高，陡度大，介质最高密度大于被分离组分的最大密度。力场比速率沉降法大10~100倍，需要高速或超速离心。原理：样品各成分在连续梯度的介质中经过一定时间的离心沉降到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的成分分离。流式细胞技术flowcytometry用途：对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。原理：包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达99%。包被细胞的液流称为鞘液，所用仪器称为流式细胞计（flowcytometer）。激光捕获显微切割技术lasercapturemicrodissection在不破坏组织结构，保存要捕获的细胞和其周围组织形态完整的前提下，直接从冰冻或石蜡包埋组织切片中获取目标细胞，通常用于从组织中精确地分离一个单一的细胞。用乙烯醋酸盐聚合体膜覆盖在被选择的细胞上，红外激光熔化膜，膜与组织在目标位置牢固结合，当膜被提起时，仅目标细胞留在膜上。五、细胞培养技术cellculture基本条件：营养环境支持物体外培养细胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。A群体培养（massculture）：将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合后形成均匀的单细胞层；B克隆培养（clonalculture）：将高度稀释的游离细胞悬液加入培养瓶中，各个细胞贴壁后，彼此距离较远，经过生长增殖每一个细胞形成一个细胞集落，称为克隆。C无菌操作技术体外培养细胞的方式群体培养（左）和克隆培养（右）原代培养（primaryculture）：从生物供体分离取得组织或细胞后在体外进行的首次培养。传代培养（subculture）：将培养的细胞从原培养瓶中加以分离，经培养基稀释后再接种于新的培养瓶中。细胞系（cellline）：原代培养细胞成功传代即为细胞系。细胞株（cellstrain）：从培养细胞中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群。克隆（clone）：亦称无性系。指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少人力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。