细胞培养技术.ppt

试剂标注规范 试剂名称 NaCl 配制浓度 0.5 mM 配制人 张三 配制日期 2016.10.21 细胞复苏（快融） （l）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37℃水浴中，使其融化（1分钟左右）。并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。 （2）用培养液稀释后低速离心10分钟。 （3）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。 （4）隔天换液，但贴壁细胞若未贴壁则勿需处理。 复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶而损伤细胞。 细胞传代 ? ? 细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。 传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。 细胞传代 1 悬浮细胞传代 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。 直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶底时，将上清培养液去除l／2一2／3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。 2 半贴壁细胞传代（Hela细胞） 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。 离心 新鲜培养基悬浮 铺板 细胞传代 3 贴壁细胞传代 采用酶消化法传代。常用的0.25％的胰酶。 吸掉上清，加入PBS缓冲液洗涤，弃掉洗液，加入适量胰酶消化液，37℃消化1分钟左右，加入含血清的培养基终止消化，并离心去上清，重新稀释后接种。 注意： 开放式操作，小心谨慎、谨防污染！ 细胞冻存（慢冻） 1 细胞冻存液（1ml/管） 基础培养基70％ 胎牛血清20％ DMSO 10％ （二甲基亚砜，一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶对细胞的损伤。） 2 细胞欲冷冻保存时， 细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？ 冷冻管内细胞数目一般为1-8x106 cells/ml 缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶。 细胞冻存 3 慢冻程序 传统方法：4℃ 10分钟→ -20℃ 30 分钟 → -80℃ 16－18 小时（或过夜）→液氮长期保存。 程序降温盒：利用异丙醇实现梯度降温（易挥发，并且易吸收空气中的水分，冷冻过程中可以辅助实现缓慢降温，每十分钟降一度）。 细胞冻存 小结四 细胞培养过程 细胞生长类型及传代方法 细胞培养过程 注意无菌操作（全程） 准备工作 复苏（快） 传代（无菌） 冻存（慢） 实验 细胞信息、 方法 冻存液成分、 培养基、耗材 程序 细胞计数 血细胞计数器：手工计数细胞 细胞计数 计算公式：细胞数/ml＝4大格细胞总数/ 4×稀释倍数× 104 细胞计数 注意事项 记上不记下，记左不记右。 吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡。 镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。 培养细胞活力测定 细胞活力测定是体外实验研究中应用最广的技术手段之一。 ? 任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成，从形态上区别死、活细胞是困难的。 培养细胞活力测定 1 细胞克隆形成率实验单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体形成肉眼可见的克隆。克隆形成率用来表示细胞的增殖能力。 克隆形成率＝（克隆形成数／接种细胞数）×100% 优点：精确、可靠，适于贴壁细胞 培养细胞活力测定 2 台盼蓝法（0.4%） 细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA 结合，使其着色。而活细胞能阻止染料进入细胞内。故活细胞不被染色，死细胞染成蓝色。 用活细胞占细胞中的百分比表示细胞活性。 培养细胞活力测定 3 四唑盐（MTT）比色法 四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝。 原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定