细胞培养技术-第二讲.ppt

三、细胞生长状况有关指标的检测方法细胞计数法01.细胞生长曲线01.细胞分裂指数01.克隆形成率01.1、细胞计数法1细胞计数法是用血细胞计数板计数细胞悬液中的细胞数目，以测定细胞增殖和调整细胞浓度。2台盼蓝染色法用于检测存活细胞数。3注：台盼蓝染色——排除检测法，由于死细胞的细胞膜通透性发生改变，染料可大量进入却不能被排出，因而细胞被染色；而活细胞能排出细胞内的染料，因而不易着色。Trypanbluestainingofadultratcardiacmyocytesinprimaryculture.Livecellsexcludethebluedye,andsoappearclear.Deadcellstakeupthedyeandappearblue.活细胞的观察检测方法ABC缩时显微镜摄影观察体外活细胞染色观察暗视野显微镜技术观察活细胞暗视野显微镜技术观察活细胞（darkfieldmicroscope)原理：利用特殊聚光器使光线不能进入物镜，经过标本的散射光线使物镜被放大，因此在黑暗背景中可呈现明亮的像。优点：反差增大，分辨率提高，可观察到5nm的微小质点。应用：观察活细胞内的细胞核、线粒体、细菌和霉菌等。缩时显微摄影术观察（time-lapsecinemicrophotagraphy，TLCM）优点：可直接记录活细胞的连续动态变化过程，能非常直观地展现细胞生长过程中的动态变化，如细胞运动、细胞分裂、细胞膜变化、细胞死亡等过程。缺点：较昂贵1体外活细胞染色就是在体外培养条件下，用某种染料对活细胞进行染色，而不影响活细胞生命活动的一种方法。利用这种方法，可以对培养物进行染色观察，经染色的培养物还可以继续进行培养。2碱性染料酸性染料（台盼蓝、刚果红、吡咯蓝）3活体染料4噻嗪类（次甲基蓝、甲苯胺蓝）恶嗪类（亮焦油蓝、亮焦油紫）丫嗪类（中性红、詹纳斯绿）三酚苯甲烷类（甲基紫、维克多利亚蓝）体外活细胞染色观察常用活体染料，一般浓度为1：10000，用生理盐水（或Hanks液）溶解后进行高压蒸汽灭菌暗处存放，可直接浸染活体细胞显微镜下观察或用于细胞的病毒蚀斑，肉眼计数空斑数目。因其毒性大，染色后细胞不能再培养。使用浓度为0.1％，可用生理盐水配制，室温保存。该染料对死、活细胞均着色，故只能测出细胞总数。用0.5％浓度的台盼蓝（trypanblue)，用PBS配制，室温保存，该染料只对死细胞着色，可测定活细胞数和计算存活百分率。中性红染色结晶紫染色台盼蓝染色二、培养细胞常用的染色方法细胞常用的染色方法细胞特殊的染色方法细胞固定的基本方法1、细胞固定的基本方法把组织和细胞的原有结构尽可能完整地保存下来，避免组织和细胞发生降解、自溶、腐败和变形等；同时，固定还可以使细胞的各部分易于着色，适于观察、长期保存和分析。固定组织、细胞的目的：尽可能选用新鲜培养物；根据检测工具、对象、目的和要求选择固定剂和固定方法。固定组织、细胞的原则：固定前的准备：各种细胞培养物，如双盖片悬滴培养物、悬液培养物、单层培养物和盖片单层培养物都可作固定材料。悬浮细胞：离心（800～1000r/min）→PBS/Hanks漂洗2～3次贴壁细胞：用镊子轻轻取出盖片→PBS/Hanks漂洗2～3次注：漂洗的目的是去除血清和附着于细胞表面的残渣，防止其妨碍染色。01简单固定液：甲醇、乙醇、甲醛、醋酸、戊二醛、苦味酸、重铬酸钾、锇酸等02混合固定液：甲醇/醋酸固定液、FAA固定液、Carnoy固定液、Bouin固定液、4％多聚甲醛-PBS固定液等03甲醇/醋酸固定液：甲醇：冰醋酸为3：1，现用现配，适用于Giemsa染色。04FAA固定液：90mL80％酒精＋5mL冰乙酸＋5mL40％甲醛，适用于盖片单层培养的细胞，固定效果好。05Carnoy固定液：较好的非水溶性固定液，60mL纯酒精＋30mL氯仿＋10mL冰乙酸，适用于显示细胞化学成分。常用固定液2、细胞常用的染色方法01020304H.E（苏木精-伊红）染色法染液配制：原理：碱性染料苏木精和酸性染料伊红分别与细胞核和细胞质发生反应，使细胞的微细结构通过颜色而改变它的折射率，从而在光镜下能清晰地呈现出细胞的图像，并能提供良好的核浆对比染色。染色步骤：05染色结果：细胞核染成红色，细胞质染成蓝色。母液配制：Giemsa粉0.5g，甘油22mL，将Giemsa粉置于研钵内先用少量甘油与之充分混合，研磨至无颗粒；然后将剩余甘油混在一起，56℃保温2h后，加入33mL纯