蛋白质分离、纯化.ppt

一、凝胶层析又叫分子筛层析。分子筛是具有三维空间网状结构的物质，有天然的，也可人工合成。根据网孔不同可制成不同规格。01分子量大的物质不能进入凝胶粒子内部，随洗脱液从凝胶粒子之间的空隙挤落下来，所以大分子物质迁移速度快；02小分子物质要通过凝胶网孔进入凝胶粒子内部，所以小分子物质迁移速度慢。原理：凝胶层析具备条件：1惰性，2水不溶性，3能高度水化。常用分子筛：葡聚糖凝胶（Sephadex）型号：G200、G150、G100、G75、G50、G25、G15分离大蛋白质、小蛋白质，除盐琼脂糖凝胶（瑞典Sepharose、美国Bio-GelA）孔径大，用于分离大分子物质聚丙烯酰胺凝胶（Bio-GelP）大分子不能进入珠内，经珠之间缝隙流出凝胶过滤层析过程示意图小分子进入葡聚糖珠内带网孔的葡聚糖珠STEP4STEP3STEP2STEP1溶胀：称取适量凝胶干粉，用约10倍蒸馏水浸泡24小时以上，待凝胶充分溶胀后，倾去上层悬浮物及蒸馏水。碱洗：用0.5MNaOH溶液浸泡半个小时，然后用蒸馏水洗至中性。酸洗：用0.5MHCl溶液浸泡半个小时，然后用蒸馏水洗至中性。平衡：用起始缓冲液浸泡凝胶，直至凝胶液pH与起始缓冲液相同。凝胶的前处理将层析柱垂直固定，加入适量溶剂排走空气。将平衡好的凝胶搅匀，连续倾入柱中，待其自然沉降至1/4~1/3高时打开下端出口，让溶剂慢慢流出，继续侵入凝胶至沉降到所需高度。装柱时要注意操作压。用3-5倍柱床体积的起始缓冲液走柱，使交换剂充分平衡，柱床稳定。装柱样品上柱、洗脱、收集如图装好层析装置，打开下端出口，使溶液流出至刚好达到凝胶胶面打开起始缓冲液阀门，连续洗脱。沿柱壁缓慢加入2ml样品，打开下端出口，使样品溶液流出至刚好达到凝胶胶面，再取少量起始缓冲液洗涤柱壁。用自动部分收集器自动或手动收集，合并同一高峰各管。再生用过的凝胶经0.5M的NaOH和HCl溶液分别处理后可以恢复其性能凝胶的保存方法02%叠氮钠或0.002%双氯苯双胍己烷凝胶的再生及保存蛋白质是由氨基酸聚合形成的聚合物，所以蛋白质也存在等电点（pI），蛋白质在溶液中带电状况同氨基酸相同，取决于所处溶液的pH值。当pIpH时，蛋白质带净负电荷；而当pIpH时，蛋白质带净正电荷。注意：阳离子交换剂本身带负电荷，阴离子交换剂本身带正电荷。二、离子交换层析可分为阳离子交换与阴离子交换。树脂类：分离氨基酸，孔径小；纤维素类：分离蛋白质，孔径大。通过改变盐浓度，辅助改变pH值进行梯度洗脱。离子交换层析阳离子交换层析过程01离子交换树脂02蛋白质03低离子强度洗脱液洗04高离子强度洗脱液洗05加样06平衡液洗07收集离子交换层析原理：依赖于蛋白质和它的配体（ligand）之间的专一识别并结合的特性来分离蛋白质。配体通常指的是能与另一个分子或原子结合（一般是非共价结合）的分子、基团、离子、或原子。但在亲和层析中，配体是通过共价键先与基质结合，配体可以是酶结合的一个反应物或产物，或是一种可以识别靶蛋白的抗体.三、亲和层析混合蛋白样品含配体溶液收集目的蛋白带有配体的树脂珠（或胶粒）洗下未结合的蛋白平衡液电泳法类型：1、区带电泳纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、粉末电泳、细丝电泳、凝胶电泳。凝胶电泳包括：琼脂糖凝胶、淀粉凝胶、硅胶凝胶、聚丙烯酰胺凝胶。聚丙烯酰胺凝胶包括：垂直板电泳、盘状电泳、等电聚焦电泳、梯度电泳、免疫电泳。2、自由界面电泳：支持物为溶液，很少用。聚丙烯酰胺凝胶电泳1．原理 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(简称Bis)在加速剂N?，N?-四甲基乙二胺(简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(简称AP)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(简称PAGE)。聚丙烯酰胺凝胶优点化学性能稳定，对pH和温度变化不敏感；重复性好；灵敏度高，可达10-6g；分辨率高。12分子量范围 适用的凝胶浓度/(%)?104 20-30 1-4×104 15-201-5×104-1×105 10-15 1×105 5-10 ?5×105