蛋白质分离纯化及鉴定.ppt

样品上柱、洗脱、收集。如图装好层析装置，打开下端出口，使溶液流出至刚好达到凝胶胶面沿柱壁缓慢加入2ml样品，打开下端出口，使样品溶液流出至刚好达到凝胶胶面，再取少量起始缓冲液洗涤柱壁。打开起始缓冲液阀门，连续洗脱。用自动部分收集器自动或手动收集，合并同一高峰各管。再生用过的凝胶经0.5M的NaOH和HCl溶液分别处理后可以恢复其性能凝胶的保存方法02%叠氮钠或0.002%双氯苯双胍己烷凝胶的再生及保存01分离蛋白质03蛋白质分子量的测定02脱盐应用聚丙烯酰胺凝胶电泳

原理聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(简称Bis)在加速剂N，N，N?，N?-四甲基乙二胺(简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(简称AP)或核黄素(VB2)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(简称PAGE)。1.1聚丙烯酰胺凝胶优点化学性能稳定，对pH和温度变化不敏感；重复性好；灵敏度高，可达10-6g；分辨率高。12分子量范围 适用的凝胶浓度/(%)?104 20-30 1-4×104 15-201-5×104-1×105 10-15 1×105 5-10 ?5×105 2-5 分子量范围与凝胶浓度的关系1.2凝胶浓度的选择与被分离物质分子量密切相关 凝胶浓度的选择与被分离物质分子量密切相关连续系统与不目前常用的多为圆盘电泳(图1)和板状电泳(图2)，两者电泳原理完全相同。01聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续系统两大类。021.3种类图1聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图

(A为正面,B为剖面)

(1)样品胶pH6.7(2)浓缩胶pH6.7

(3)分离胶pH8.9(4)电极缓冲液pH8.3

蛋白质分离纯化及鉴定凝胶过滤层析法聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶过滤层析法01试验原理利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。02凝胶层析的原理Kd=(Ve-Vo)/Vi条件温和操作简便层析柱可反复使用损失少回收率高优点凝胶及凝胶柱的选择Sephadex:交联葡聚糖G-10，15，25，50，75，100，150，200；得水值X10根据不同分子量选择不同凝胶Sepharose：琼脂糖凝胶Bio-GelABio-GelP：聚丙烯酰胺凝胶分子筛Sephacryl：用N，N-亚甲双丙烯酰胺交联的葡聚糖凝胶凝胶柱的选择酸洗：用0.5MHCl溶液浸泡半个小时，然后用蒸馏水洗至中性。溶胀：称取适量凝胶干粉，用约10倍蒸馏水浸泡24小时以上，待凝胶充分溶胀后，倾去上层悬浮物及蒸馏水。碱洗：用0.5MNaOH溶液浸泡半个小时，然后用蒸馏水洗至中性。平衡：用起始缓冲液浸泡凝胶，直至凝胶液pH与起始缓冲液相同。凝胶的前处理将层析柱垂直固定，加入适量溶剂排走空气。将平衡好的凝胶搅匀，连续倾入柱中，待其自然沉降至1/4~1/3高时打开下端出口，让溶剂慢慢流出，继续侵入凝胶至沉降到所需高度。装柱时要注意操作压。用3-5倍柱床体积的起始缓冲液走柱，使交换剂充分平衡，柱床稳定。装柱