6、蛋白质的特性和分离纯化.pdf

第七章 蛋白质的性质和分离纯化 第一节 蛋白质的重要性质 一、蛋白质的两性解离和电泳现象 蛋白质是由氨基酸通过肽链连接起来的大分子，除了N-末端游 离氨基和C-末端的游离羧基外，还含有许多可解离的侧链基团， 因此蛋白质也是一种两性电解质。但是，蛋白质解离情况与单个 氨基酸相比要复杂得多，除了可解离基团的数目多外，还有部分 可解离基团因所处的微环境不同，解离情况明显不同，甚至于不 能解离。 1、蛋白质等电点 当蛋白质处在某一pH 的溶液时，蛋白质分子所带的净电荷为 零，此时溶液中的pH就称为蛋白质的等电点（pI ）。 2、蛋白质的等离子点 在没有其它盐类干扰的情况下，使蛋白质分子所带净电荷为零 时的pH ，称为等离子点。等离子点是蛋白质的特征常数。 1 3 、处在等电点时蛋白质的许多物理特性会发生变化 在等电点时，蛋白质的溶解度、粘度、渗透压、膨胀性和 导电能力均表现为最小。 4、蛋白质的电泳现象 蛋白质只在等电点pH 时，净电荷为零，其它任何pH条件都会 带上电荷。 在pH 大于等电点的溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中 向正极移动；在pH 小于等电点的溶液中，蛋白质粒子带正电 荷，在电场中向负极移动。这种现象称为蛋白质电泳 (Electrophoresis) 。利用蛋白质的电泳现象，可以将蛋白质进行分 离纯化。 不同的电泳方式和电泳结果 2 二、蛋白质的分子大小 蛋白质是分子量很大的生物分子，分子质量一般为10~1000kD。 由于很多蛋白质的氨基酸组成都不知道，所以我们没有办法根据 蛋白质的组成来计算其分子量。 蛋白质的分子质量一般是利用其某些理化性质来进行测定。 1、根据化学成分测定最小相对分子质量 此法首先利用化学分析方法测定蛋白质分子中某一特殊成分的 百分含量，然后，假定蛋白质分子中该成分只有一个，据其百分 含量可计算出最低相对分子质量： 最小相对分子质量＝（已知成分的相对分子、原子质量）/ 已知 成分的百分含量 如果蛋白质分子中所含已知成分不是一个单位，则真实相对分 子质量等于最小相对分子质量的倍数。 2、超速离心法 在60 000～80 000r/min的高速离心力作用下，蛋白质分子在溶 液中会出现沉降现象。 用光学方法测定界面移动的速度即为蛋白质的离心沉降速度。 蛋白质的沉降速度与分子大小和形状有关。 沉降系数是溶质颗粒在单位离心场中的沉降速度，用S表示。 -13秒。 一个S单位，为1×10 相对分子质量越大，S值越大；蛋白质的沉降系数：1～200S 。 由沉降系数S可根据斯维得贝格〔Svedberg 〕方程计算蛋白质 分子的相对分子质量： M=RTS/D(1 －V ρ) R ：气体常数; T：绝对温度; D：扩散系数; ρ：溶剂的密 度; V：大分子物质的偏微比容（为密度的倒数）。 3 3 、凝胶过滤法 凝胶过滤（色谱）所用介质 为多孔的凝胶珠，其内部为多 孔网状结构。 一定型号的凝胶网孔大小一 定，只允许相应大小的分子进 入凝胶颗粒内部，大分子则被 排阻在外。 洗脱时大分子随洗脱液从颗 粒间隙流下来，洗脱液体积 小；小分子在颗粒网状结构中 扩散移动，移动距离长，后洗 脱下来，洗脱体积大。 测定蛋白质分子量一般用葡 聚糖凝胶。 商品名：Sephadex 洗脱体积与分子大小成反比 ∷ 测得几种标准蛋白质（已知 分子量）的洗脱体积〔Ve 〕 以相对分子质量对数（lgMr ） 对Ve作图，得标准曲线 再测出未知样品洗脱体积 〔Ve 〕 从标准曲线上可查出样品蛋 白质的相对分子质量