β-葡萄糖苷酶分离纯化.doc

本章以裂褶菌DS1液体发酵粗酶液为研究对象，对粗酶液中β-葡萄糖苷酶先后进行硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析、Sephacry1S-200分子筛层析等方法对其进行分离纯化，并在此基础上对该酶的一般性质进行研究。 4.1 材料与方法 4.1.1 材料 4.1.1.1菌种: 裂褶菌（S. commune）DS1，由华中科技大学生命科学与技术学院资源与环境微生物所提供 4.1.1.2培养基: 斜面培养基(PDA培养基)：马铃薯(200g)，蔗糖(20g)，琼脂(30g)，水（1000mL） 种子培养基(PDY培养基)：马铃薯(200g)，蔗糖(20g)，水（1000mL） 发酵培养基：纤维素(3.2 g),蛋白胨(3.0 g), KH2PO4(0.2 g), Ca(NO3)2.4H2O(1.5 g), MgSO4.7H2O(0.5 g) ,水(100mL) 4.1.1.3 缓冲溶液 0.2mol/L pH=8.10Tris-HCL缓冲溶液：称取6.055g Tris溶于500mL双蒸水中；量取4.2mL盐酸溶液溶于500mL双蒸水中；将262mL盐酸溶液和500mL双蒸水（含Tris）混合即成0.2mol pH=8.10Tris-HC缓冲溶液。 4.1.1.4试剂: 对硝基酚-β-葡萄糖苷（pNPG） Sigma公司 对硝基酚（NPG） Sigma公司 DEAE-Sepharose Fast Flow Amersham公司 Sephacry1 S-200 Amersham公司 蛋白胨 北京奥博星生物技术有限责任公司 硫酸铵 上海实验试剂有限公司 过硫酸按 Fluka公司 考马斯亮蓝R-250，G-250 北京鼎国生物技术发展中心 丙烯酞胺、甲叉双丙烯酞胺 中国医药(集团)上海化学试剂公司 TEMED Sigma公司 PMSF Sigma公司 SDS Sigma公司 Tris 上海伯奥生物科技有限公司 甘氨酸 Sigma公司 甲硫氨酸 上海伯奥生物科技有限公司 低分子量标准蛋白 根生化科技（北京）有限公司 PEG-20000 津市科密欧实验化学试剂开发中心 快速银染试剂盒 碧云生物技术研究所 芦丁（≥95％） 国药集团化学试剂有限公司 槐角苷（90％） 实验室自制 槐角提取物（10：1） 西安园生物技术有限公司 4.1.1.4 仪器 TG-332A 微量分析天平 上海天平仪器厂 低速大容量离心机 上海精密仪器仪表有限公司 电泳仪(DYY-Ш型) 北京六一仪器厂 UV2000紫外-可见光分光光度计 尤尼柯(上海)仪器有限公司 4.1.2 方法 4.1.2.1将菌种DS1接种到PDA斜面活化3d后，挑取一定大小的菌块接入PDY培养基中，培养3d制备一级液体种，再以10％的接种量接入PDY培养基中培养3 d制备二级液体种。按10%的接种量将二级种加入含有100mL发酵培养基中，于27℃，150 r/min摇床上培养。每天取一瓶发酵液在4000 r/min条件下离心10min后，取上清液在标准条件下用pNPG测定β-葡萄糖苷酶的活性。如此持续取三角瓶内的培养液直至培养的第10d为止β-葡萄糖苷酶的活性 4.1.2.3对硝基酚标准曲线的绘制 见方法2.1.2.2。 4.1.2.4 β-葡萄糖苷酶酶活测定 对硝基酚-β-葡萄糖苷（pNPG）法[54]测定β-葡萄糖苷酶酶活。 4.1.2.5 蛋白质含量的测定 考马斯亮蓝G250法。将测试酶液稀释到一定浓度，取0.5mL于试管中再加入2.5mL考马斯亮蓝G250试剂，摇匀，静置10min后，在595nm条件下进行蛋白质含量测定。以牛血清蛋白做标准曲线为Y=4.905X-0.0131，R2=0.9928(Y为吸光值，X蛋白质含量)。 4.1.2.6 硫酸铵分级沉淀、脱盐和浓缩 1. 确定盐析时饱和度范围 （1）取粗酶液7份，每份15mL; （2）分别用饱和度为20％-80%相对饱和度的(NH4)2SO4于4盐析12h; （3）以不加硫酸铵的酶液为对照，于冰箱中于4盐析12h； （4）8500 r/min于4℃离心20min; （5）分别收集各离心管中的上清液和沉淀，并用pH5.0的乙酸-乙酸钠恢复至原体积，在A595与A410条件下分别测定其蛋白质含量和β-葡萄糖苷酶活力。 2. 最佳pH条件下盐析 （1）在100ml粗酶液中缓慢加入硫酸铵至X1%饱和度； （2）4静置12h; （3）4，8500r/min条件下离心20min，取上清液，测量上清液体积； （4）在上清液中继续缓慢加硫酸铵至X2%饱和度； （5）4静置12h; （6）4, 8500r/min条件下离心20min