2018年大型潘N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶纯化产物的动力学特性.doc

大型潘N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶纯化产物的动力学特性 　　塑兰垒兰壁堂 竺!!竺竺:翌堡鱼 文献著录格式:曾晨杰,李少南.大型泽N-乙酰.13.D.氨基葡萄糖苷酶纯化产物的动力学特性[J].浙江农业科学,2013(9):1151—1156? 　　大型潘N一乙酰一13一D一氨基葡萄糖苷酶 　　纯化产物的动力学特性 　　曾晨杰1,李少南2 　　(1.浙江大学农业写生物技术学院植物保护系,浙江杭蝌310029;2,浙江大学农药与环境毒理研究所,浙江杭州310029) 　　摘 要:为制备免疫原以测量个体生长和繁殖过程中所释放的几丁质酶,从大型涵(Daphnia magna)体内 提纯了N一乙酰.B.D一氨基葡萄糖苷酶(EC 3.2.1。52),经硫酸铵沉淀分级分离、DEAE Sephadex A-25砚离子交换 柱层析和Sephadex G-150分子筛柱层析纯化等步骤,酶的纯化倍数为20.09。纯酶比活力为2243380U?mg~。 酶分子中各亚基的分子量分别为128,99和7l Ku。根据测试,酶促反应的米氏常数为0.300mmol?L~,最大 反应速度为0.072la,mol?mg~?rain~。酶催化底物分解的最适pH为7.0,最适反应温度为45℃;酶在值 4.2—7.8的范围内活性处于高位;在不高于35℃的温度下处理30rain,酶活性下降不明显。至于从大型潘培养 液中获得的NAGase,其催化底物分解的最适pH值为7.4,最适反应温度为40℃,该酶在pH值4.6—7.8的范 围内活性处于高位,在不高于40℃下处理30min,酶活性下降不明显。这显示被提纯的酶和培养液中分离的酶 在温度、pH以及热稳定性和酸碱稳定性方面均具有较高程度的相似性,有可能属于相同分子型。 　　关键词:甲壳类动物;壳二糖酶;分离纯化;动力学性质 　　中图分类号:S 917.4文献标志码:A 文章编号:0528-9017(2013)09.1151-06 　　大型潘(Daphnia magna)属于节肢动物门甲 壳纲鳃足亚纲双甲目肢角亚目潘科。作为浮游动物 的代表,大型溢以水生单细胞藻类和原生动物等为 食,同时又是鱼类和大型甲壳类动物的食料,因此 具有重要的经济和生态价值。大型潘具有生活周期 短、繁殖快、材料易得、易于实验室培养等优点, 故常作为标准化试验生物而用于各种化学品的急、 慢性毒性测试¨。2J。不仅如此,人们还以大型搔群 体、个体,以及个体以下的应激反应来显示水体污 染物的客观存在¨“J。 　　几丁质广泛分布于动物、植物及微生物中,是 重要的有机碳和有机氮源。凡丁质在自然条件下的 降解依赖于几丁质水解酶系(chitinolytic enzymes)。该酶系由N一乙酰一B—D一氨基葡萄糖苷酶 (6一N-Acetyl—D—glucosaminidase,简称NAGase、 chitobase或hexosaminidase,通用名EC 2, 在有些文献中又被称为EC 0 　　包括大型溢在内的水生节肢动物在生长和繁殖 过程中需经历多次脱壳,此间会将脱壳液连同其中 的几丁质酶一起释放到水中。单位体积的水中节肢 动物数量越多,水中几丁质酶的含量越高。随着个 体的生长以及动物个体数量的增加,水中几丁质酶 的含量也相应增加。通过对几丁质酶的测量,可大 致了解水生节肢动物在某一时刻的生物量以及在某 一时段的生物量变化¨。”。。 　　几丁质酶的涌量方法有多种。其中之一是通过 抗原一抗体反应。为此首先要制备免疫原,释放于 水中的几丁质酶是制备免疫原的理想选择。考虑到 几丁质酶在水中含量很低,有效分离有一定困难。 本文以大型潘为材料,从其体内分离NAGase,并 加以纯化。根据现有资料,节肢动物体内的 bIAGase有多种分子型,处于机体不同的部位,承 担不同的生理功能,且性质(包括免疫化学性质) 各不相同¨6。19J。为了推断纯化NAGase作为免疫 　　收稿日期:2013-05一11 　　基金项目:浙江省自然科学基金(LYl2807008);国家自然科学基金 　　作者简介:曾晨杰(1987一),男,江苏无锡人,硕士生,从事生态毒理学研究工作。E-mail:576988209@qq.corn。 通信作者:李少南,男,副教授,谗士。从事农药生态毒理研究工作。E-mail:snli@。 　　万方数据 　　圜 澎社右簟种学 2013年第9期 　　原的适用性,本文将纯化NAGase与水中NAGase 就动力学性质进行比较研究。 　　1材料与方法 　　1.1材料 　　大型潘潘种来源于中国疾病预防控制中心环境 与健康相关产品安全所,属于62DlVl生物株。室内 条件下,潘种在M。营养液中培养,以小球藻 Chlorella vulgaris为饲料,水温(