论文-β葡萄糖苷酶的筛选及其酶学性质和动力学的研究.doc

四川农业大学本科生毕业论文（设计）开题报告 毕业论文（设计）题目 选题类型 应用基础型 课题来源 自选项目 学 院 生命科学与理学院 专 业 化学生物学 指导教师 职 称 姓 名 年 级 学 号 β—葡萄糖苷酶葡萄糖苷水解酶，它属于纤维素酶类。是一种能催化水解芳基或烃基与糖基原子团之间的糖苷键生成葡萄糖的酶。根据其底物特异性将其归类于烃基β—葡萄糖苷酶、纤维二糖酶、或水解烃基-β-糖苷基和寡聚糖的酶类。又据BGL的基因序列的不同有β-葡萄糖苷酶A和β-葡萄糖苷酶B之分。两者尽管同属β-葡萄糖苷酶。但其底物特异性却不尽相同。BGL在自然界广泛分布，几乎在所有的生物体中都有存在，因其来源不同而性质各异，在人类的糖原降解和动物、植物、微生物的糖类代谢方面具有重要的生理功能。随着从大量嗜热性细菌分离出了BGL后，由于其高度的耐热稳定性及高活性而对纤维质糖化工业极为有利，日益受到人们的重视。与美国，日本等国相比，我国的研究工作主要还在生产菌种的筛选方面，关于其性质，化学结构，催化机制等方面的报导几乎仍是空白。 BGL 参与生物体的糖代谢，对维持生物体的正常生理功能起着重要作用，它把细菌的 BGL 在酶解纤维素时就起着至关重要的作用，它把由纤维素酶降解生成的纤维二糖和三糖转化成可发酵的葡萄糖。而哺乳动物和人体内的乳糖酶/根皮苷(LPH)水解酶也含有一种芳基-β-葡萄苷酶，LPH因其涉及成人型乳糖酶缺乏病----一种常见的人体基因紊乱病而被广泛研究。 一直以来，人们认为BGL参与微生物糖代谢的非磷酸途径，Kengen等人研究发现，它其实参与的是EMP糖酵解途径，是参与双歧杆菌糖代谢的有关酶系之一。 BGL的另一主要应用是用于降解纤维素。纤维素酶转化纤维成葡萄糖的过程细节和作用机理还不清楚或未有定论。一般认为由内切葡聚糖作用于微纤维的非结晶区，纤维二糖水解酶再从非还原端依次分解产生纤维二糖和三糖，后者再由BGL水解成葡萄糖。纤维素是葡萄糖以β-1，4-键结合聚合物，为植物细胞壁的构成成分，占植物干重的1/2-1/3。全球一年间由光合作用生产的纤维素达1000亿吨，是最丰富的可再生资源。将植物纤维应用于发酵食品工业原料，对人类将是一个重大的贡献，可以使我们摆脱对谷物粮食的绝对依赖，缓和世界资源紧缺。另外，根据BGL的半乳糖酶活力还可将其应用于乳品工业来分解乳糖，与其它酶协同作用 生产葡萄糖与单细胞蛋白，以及饲料工业和医药领域等。 2 研究的主要内容 本实验主要对产BGL菌进行筛选及BGL酶活性的测定。 3 研究方案 3.1 技术路线 3.2 实验材料与仪器 .1 土样 **************** 3.2.2 主要生化试剂和仪器 .3 液体培养基（%） ************** 3.2.5 PDA培养基.6 产酶培养基.7 酶试剂溶液 3.3 实验方法 .1 β-葡萄糖苷酶产生菌的筛选 取土样1g，溶于99ml无菌水，配成10-2悬浊液，再逐步稀释成10，10，10，10，各吸取1ml于液体培养基中进行培养，温度为30℃，时间为3d。然后再分别在PDA培养基上按常规涂布方法分离培养3d，获取单菌落。喷涂1mol/L的Na2CO3溶液，挑取有黄色透明圈的单菌落于产酶培养基上30℃培养3d，以纤维二糖及pNPG为底物测各自β-葡萄糖苷酶活力。选择酶活高者为研究菌种。 3.3.2 初酶液的提取 产酶培养基发酵培养3d后，加入65ml蒸馏水（与培养前加入的Mandels营养液35ml总体积为100ml，即固液比例约为1：14）于40℃水浴浸提1h，压滤取滤液，在4℃下于3500r/min冷冻离心20min，取上清粗酶液备用。 3.3.3 β-葡萄糖苷酶的分离 粗酶上样到预先用柠檬酸-磷酸缓冲液（0.02mol/L，PH5.0）平衡的Sephadex G-150柱（2.5×90cm）。收集β-葡萄糖苷酶活力峰，超滤浓缩除盐后，上样到相同缓冲液平衡的DEAE-Sephadex A-50柱（3.3×30cm），用0～0.4mol/L NaCl线性梯度洗脱（2×500ml）。收集高活力蛋白峰，超滤除盐后，上样到想通缓冲液平衡的DEAE-Sephadex A-50柱（2.0×30cm），用0～0.3mol/L NaCl梯度洗脱 3.3.4 酶活测定 3.3.4.1 酶活测定 标准曲线的制作：分别吸0.1%葡萄糖标准液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0毫升于试管1、2、3、4、5、6号，用蒸馏水将每支试管加水到1ml，再加1mLDNS试剂，充分混合后在沸水中煮沸5 分钟，冷却后用蒸馏水稀释至10ml，用7230分光光度计在波长540nm处测其OD值，以1号试管为对照。取0.5ml一定稀释度的