第四章分子生物学研究法修定版(13年)讲课.ppt

第四章 分子生物学研究法 本章内容 掌握： 细菌转化；DNA序列测定；基因敲除；RNA干扰；酵母双杂交；cDNA文库 了解： 其他相关分子技术 1DNA相关技术1.1细菌转化 定义：一个细菌细胞摄入并表达外源DNA的过程 (书上：指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的？DNA而导致性状特征发生遗传改变的生命过程) （1）CaCl2法 转化过程中的受体细菌应是限制修饰系统缺陷型菌株并且0℃低渗CaCl2处理成感受态。 通过短暂的热刺激（42℃）可以使细菌摄 入外源DNA （2）电击法（电脉冲导致细胞膜凹陷随着跨膜电压的增加造成疏水性孔洞变为亲水性孔洞） *外源基因在细菌中的表达 目的基因体外扩增（PCR若是真核需从CDNA文库扩增或cDNA为模板扩增）（见问题） 与载体连接（酶切）（双酶切，单酶切） （表达载体/克隆载体、多克隆位点-包含多个(最多20个)限制性酶切位点(restriction site)的一段很短的DNA序列。也称为多位点接头(polylinker),是基因工程中常用到的载体质粒的标准配置序列 ） 转化 筛选（质粒抗性标记，蓝白斑*，（菌落PCR） 诱导表达 　蓝白斑筛选的原理 :载体含lacZ的调控序列和N端。宿主细胞可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的。（lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补）。由α-互补而产生的lacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。 计算 插入频率:白色菌落数/(白+蓝)菌落数 转化频率：每ugDNA转化菌落数 1.2基因文库（cDNA文库）的建立 gene bank（library）：一个含有基因组各个DNA片段的克隆的集合。 cDNA：以mRNA为模板在逆转录酶作用下形成的DNA。 cDNA有组织特异性（都是该组织细胞现在表达的基因） cDNA文库：以mRNA为基础在逆转录酶作用下，逆转录出DNA克隆形成的集合 cDNA文库的建立 1.高质量的mRNA的制备 利用3’polyA尾巴，将用生物素标记的寡聚（dT）引物与细胞总RNA共温育，加入与微磁球相连的抗生物素蛋白，用磁场吸附通过寡聚（dT）引物与抗生物素蛋白及强力微磁球相连的mRNA ②mRNA体外合成DNA(反转录) 使用无Rnase 活性的反转录酶 （防止降解mRNA） 在反转录系统中加人寡聚（dT）及随机引物R6，以保证得到全长cDNA 应选用活性较高的反转录酶及甲基化dCTP，保证所获得双链cDNA的方向性 （第一条链甲基化，两端不同的酶切位点以保证第一条链与另一条链区别开。编码表达蛋白的是哪条链?） ③克隆 在组织和培养的细胞中，各种mRNA的含量是极不相同的，根据mRNA分子含量的多寡（丰度）可以将mRNA划分为高丰度、中丰度和低丰度3种不同的类型 克隆数量与涵盖概率有如下关系 N=ln(1-P)/ln(1-1/n) N:克隆数 P：某个基因被文库所包含的概率（要求大于99%） 1/n：每一种低丰度的mRNA占总mRNA的分数。 则根据表中数据，cDNA文库所需要的最少克隆数为 cDNA文库的构建可以保证大规模测序等基因组学研究 1.3SNP技术 SNP 单核苷酸多态性 分子构象由于碱基的不同在电泳或高效液相检测中移动性不同 作用 解释不同个体对药物敏感性差异 犯罪身份，亲子鉴定，器官移植配对筛选 1.4核酸序列分析 人工法：适用于小片段DNA,需要放射性物质，安全性低 酶法（Sanger），又称合成法、末端终止法、双脱氧法 化学法（Maxam和Gilbert） 自动法：适用于较大的片段 序列自动分析仪 **最新方法： 1.来自斯坦福大学应用物理学系的研究人员在2006年8月11日的Science杂志上发表文章，介绍了一种利用单个RNA聚合酶分子运动的DNA测序新方法，受到各方的关注。 2.2011年2月韩国浦项工学大学化学学科金光秀教授 发明的新方法（见下页介绍） 1 研究人员发现在转录中核苷酸将限制转录的速度，聚合酶会在稀有碱基的位置上停滞不前。利用一种能够分辨碱基对的超稳定捕捉装置（ultrastable optical trapping apparatus）监控四种核苷酸的数量受限情况下的转录。从转录暂停记录的排列模型分析中，我们能够确定DNA的序列。该原理的证据证明核酸酶的前进可以用来直接提取DNA序列的信息。 2韩国浦项大学化学学科金光秀教授研发出了一种高速DNA破译方法，可以利用拥有碳原子层的石墨带状体阅读