第五章分子生物学研究法(上)3讲课.ppt

分子生物学基本研究法（上）DNA、RNA及蛋白质操作技术 5.4 SNP的理论与应用 SNP的定义 定义：单核苷酸多态性 ( single nucleotide polymorphism，SNP) 主要是指在基因组DNA序列中由于单个核苷酸的突变而引起的多态性。 是第三代遗传标记。 5.4.1 SNP概述 单倍型：是指位于染色体上某一区域的一组相关联的SNP等位位点。 SNP分类： cSNP 同义cSNP 非同义cSNP pSNP rSNP 5.4.2 SNPs经典检测方法 一大类是以凝胶电泳为基础的传统经典的检测方法,如: 1 . 限制性片段长度多态性法 PCR-RFLP ; 2 .单链构象多态性法 PCR-SSCP ; 3 . 变性梯度凝胶电泳 ( denaturing gradient gel eletrophoresis DGGE ); 4 .等位基因特异性 PCR ( allele specific PCR, ASPCR )等等 PCR-RFLP方法 原理：利用限制性内切酶的酶切位点的特异性， 用两种或两种以上的限制性内切酶作用于同一DNA片 断，如果存在SNP位点，酶切片断的长度和数量则会 出现差异，根据电泳的结果就可以判断是否SNP位 点。 特点：该技术应用的前提是SNP的位点必须含有该 限制内切酶的识别位点，它是SNP筛查中最经典的 方法之一. PCR-RFLP原理图 单链构象多态性(SSCP) 原理：单链DNA 在中性条件下会形成二级结构，不同的 二级结构在电泳中会出现不同的迁移率。这种二级结构依赖 于碱基的组成，单个碱基的改变也会影响其构象，最终会导 致在凝胶上迁移速度的改变。 在非变性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链 DNA 和RNA 分 子依其单碱基序列的不同而形成不同的构象，这样在凝胶上 的迁移速率不同，出现不同的条带，检测SNP。 特点：由于该方法简单快速，因而被广泛运用于未知基因突变的检测。这种方法的弊端在于不能确定突变类型和具体位置。 变性梯度凝胶电泳（DGGE） 原理：是利用长度相同的双链 DNA片段解链温 度不同的原理,通过梯度变性胶将 DNA片段分开 的电泳技术。 电泳开始时,DNA 在胶中的迁移速率仅与分 子大小有关, 而一旦DNA 泳动到某一点时, 即到 达该DNA 变性浓度位置时, 使得DNA 双链开始 分开,从而大大降低了迁移速率。当迁移阻力与电 场力平衡时, DNA 片段在凝胶中基本停止迁移。 由于不同的DNA 片段的碱基组成有差异, 使得其 变性条件产生差异, 从而在凝胶上形成不同的条 带。 等位基因特异 PCR ( AS-PCR) 原理：根据 SNP位点设计特异引物,其中一条链(特 异链)的3′末端与 SNP位点的碱基互补(或相同) , 另一条链(普通链)按常规方法进行设计,因此,AS- PCR技术是一种基于SNP的PCR标记。因为特异引 物在一种基因型中有扩增产物,在另一种基因型中没 有扩增产物,用凝胶电泳就能够很容易地分辨出扩增 产物的有无,从而确定基因型的 SNP。 5.4.3 SNPs高通量的检测方法 另一大类检测方法是近些年来发展起来的, 高通 量、 自动化程度较高的检测 SNPs的方法,较为常用 的有: 1 . DNA测序法; 2 . DNA芯片检测; 3 . 飞行质谱仪 (MALDI- TOFMS )检测; 4 . 变性高效液相色谱 ( DHPLC )法等等 DNA测序法 直接测序是最容易实施的SNP检测方法。 原理: 通过对不同个体同一基因或基因片段进行测 序和序列比较, 以确定所研究的碱基是否变异, 其检 出率可达100%。 特点：可以得到SNP 的类型及其准确位置等SNP分 型所需要的重要参数。 基因芯片技术( Genechips) 原理:是将具有特定碱基序列的探针固定在特殊的载体上，待测基因经提取、荧光标记后，与固定好的探针进行杂交，最后根据荧光的强度和种类测出待测序列的碱基类别。 特点：基因芯片具有信息量大和自动化程度高的 突出优点。但它也存在若干问题: 芯片造价高昂, 所 需设备贵重, 不利于普及应用。 MALDI-TOF 原理：是将变性的单链PCR产物通过与硅芯片上 的化合物共价结合后, 在硅芯片上进行引物的退火, 延伸反应, 突变部位配对的碱基与正常配对的碱基 不相同。根据引物在延伸反应中所结合的不同碱基 的不同质量在质谱仪上显示