第五章分子生物学基本研究法上.ppt

Get Entry Vector Get Expression Vector Get cDNA TOPO LR 120 AP2/EREBP genes were cloned Feng JX et al (2005) A systematic annotation update via cDNA sequence analysis and comprehensive profiling of developmental, hormonal or environmental responsiveness of the Arabidopsis AP2/EREBP transcription factor gene family. PMB 59: 853-868. 5. 5. 4 基因的图位克隆法（Map-based cloning） 所有具有某种表现型的基因都可以通过该方法克隆得到。 通过构建遗传连锁图，将目的基因定位到某个染色体的特定位点，并在其两侧确定紧密连锁的RFLP或RAPD分子标记。 通过对不同的生态型及限制性内切酶和杂交探针的分析，找出与目的基因距离最近的分子标记，通过染色体步移法将位于这两个标记之间的基因片段克隆并分离出来，根据基因功能互作原理鉴定目的基因。 图5-26 染色体步移法克隆基因示意图 在RFLP作图中，连锁距离是根据重组率来计算的，1cM（厘摩）相当于1%的重组率。人类基因组中，1cM≈1000kb；拟南芥菜中，1cM≈290kb；小麦中，1cM≈3500kb。 用图位克隆法获得水稻脆杆基因BCl 将BCl定位于水稻3号染色体（Chr3）分子标记C524a和RM16之间； B. 覆盖BCl位点的BAC大片段。 C. BCl位点的精细定位。BCl位点被定位于分子标记P2和P4之间与P3共分离。 D. BCl基因结构。红色为编码区，白色为5’和3’非翻译区，黑色线段为内含子。bcl-1和bcl-2表示两个突变位点。 Li, Y., Qian, Q., Zhou, Y., Yan, M., Sun, L., Zhang, M., Fu, Z., Wang, Y., Han, B., Pang, X., Chen, M., and Li, J. (2003). BRITTLE CULM1, which encodes a COBRA-like protein, affects the mechanical properties of rice plants. Plant Cell 15, 2020–2031. 5. 6 蛋白质与蛋白质组学技术 蛋白质组学是蛋白质（protein）和基因组（genome）研究在形式和内容两方面的组合，该技术致力于研究某一物种、个体、器官、组织或细胞在特定条件、特定时间所表达的全部蛋白质图谱。 蛋白质组与基因组既相互对应又有显著不同，基因组是确定的，每个个体只有一个基因组，而基因的表达调控水平（蛋白组）却会发生显著的变化。 由于蛋白质分离（双向电泳和高效液相层析技术）和鉴定技术（现代质谱）的进步，以及基因组学和生物信息学的交叉渗透，蛋白质组学研究在已经获得了长足的发展。 双向电泳技术（Two－Dimensional Electrophoresis，2-D） 等电聚焦（Isoelectric focusing，IEF）及SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS）双向电泳技术。蛋白质是两性分子，在不同pH缓冲液中表现出不同的带电性，因此，在两性电解质电泳体系中，不同等电点的蛋白质会聚集在介质上不同的区域（等电点）从而被分离。 蛋白质的分子量决定了SDS-蛋白复合物在凝胶电泳中的迁移率，因为聚丙烯酰胺凝胶中的SDS带有大量的负电荷，与之相比，蛋白质所带电荷量可忽略不计。因此，蛋白质在SDS凝胶电场中的运动速度和距离完全取决于其分子量。 2D-E map of protein from Arabidopsis seeds 30h after germination Quantitative analysis of cp29A and cp29B from seeds at 0-96 h after germination 野生型和突变体棉花胚珠总蛋白质样品的双向电泳图谱比较 蛋白质的质谱分析技术 现行质谱仪主要有三个连续的组成部分，即离子源，离子分离区和检测器。 较常用的有基质辅助的激光解析电离-飞行时间质谱（Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight spectrometry，MALDI-TOF）和电喷雾质谱（Electrospray ionization，ESI-MS）。 MALDI-TOF的工作原理：