第五章分子生物学基本研究法.ppt

分子生物学基本研究法 5.1 重组DNA技术发展史上的重大事件 5.2 DNA操作技术 5.3 基因克隆的载体系统和工具酶 5.4 基因的分离与鉴定 5. 1 重组DNA技术发展史上的重大事件 三大成就： 第一，在20世纪40年代确定了遗传信息的携带者、即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题； 第二，50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题； 5. 2 DNA操作技术 5. 2. 1核酸的分离纯化及电泳 5. 2. 2 核酸的分子杂交 5. 2. 3 细菌转化 5. 2. 4 核苷酸序列分析 5. 2. 5 基因扩增 5. 2. 1核酸的分离纯化及电泳 核酸分离提取的原则： （1）应保证核酸一级结构的完整性 （2）排除其它分子的污染 5. 2. 2 核酸的分子杂交 将带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA混合在一起，其相应的同源区段就会退火形成双链结构。如果退火的核酸来自不同的生物有机体，所形成的双链分子就被称为杂种核酸分子。 5. 2. 3 细菌转化 所谓细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。提供转化DNA的菌株叫作供体菌株，接受转化DNA的细菌菌株则被称为受体菌株。 5. 2. 4 核苷酸序列分析 1、Sanger双脱氧链终止法 Sanger等人于1977年发明了利用DNA聚合酶的双脱氧链终止原理测定核苷酸序列的方法，该法有时也称为引物合成法或酶催引物合成法。 双脱氧末端终止法（ Sanger法） 5. 2. 5 基因扩增 首先将双链DNA分子加热分离成两条单链，DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物中的四种dNTP合成新生的DNA互补链。 因为DNA聚合酶需要有一小段双链DNA来启动（“引导”）新链的合成，所以，新生DNA链的起点由寡核苷酸引物在模板DNA链两端的退火位点所决定。 5. 3 基因克隆的主要载体系统 和工具酶 5. 3. 1 质粒DNA及其分离纯化 5. 3. 2 重要的大肠杆菌质粒载体 5. 3. 3 λ噬菌体载体 5. 3. 5 pBluescript噬菌粒载体 5. 3. 6 基因工程的主要工具酶 5. 3 基因克隆的主要载体系统 和工具酶 5. 3. 1 质粒DNA及其分离纯化 细菌质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体并能自主复制的遗传成份，绝大多数质粒都是由环形双链DNA组成的复制子。 5. 3. 2 重要的大肠杆菌质粒载体 1、pSC101质粒载体 是一种严紧型复制控制的低拷贝数的大肠杆菌质粒载体，平均每个寄主细胞仅有1~2个拷贝。长9.09kb，编码有四环素抗性基因（tetr），具有EcoRI、HindIII、BamHI、SalI、XhoI、PvuII以及SmaI等7种限制性核酸内切酶的单切割位点，在HindIII、BamHI和SalI等3个位点克隆外源DNA，都会导致tetr基因失活。 5. 3. 3 λ噬菌体载体 噬菌体可在脱离寄主细胞的状态下保持自己的生命，但一旦脱离了寄主细胞，就既不能生长也不能复制，因为大多数的噬菌体只能利用寄主核糖体、合成蛋白质的因子、各种氨基酸及能量代谢体系进行生长和增殖。 5. 3. 5 pBluescript噬菌粒载体 pBluescript是指由Stratagene公司发展的一类从pUC载体派生而来的噬菌粒载体，简称为pBS（+/-），如今则更多地叫作pBluescript KS（+/-）或pBluescript SK（+/-）。 5. 3. 6 基因工程的主要工具酶 限制性核酸内切酶 DNA连接酶 其他工具酶 表5-2 重组DNA实验中常见的主要工具酶 5. 4 基因的分离与鉴定 5. 4. 1 DNA片段的产生与分离 5. 4. 2 重组体DNA分子的构建 5. 4. 3 cDNA基因克隆 5. 4. 4 克隆基因的分离 5. 4. 1 DNA片段的产生与分离 最简单的办法是利用限制性核酸内切酶消化供体基因组DNA，并直接将消化产物与载体分子相连接。这个方法最明显的缺点是所形成的重组体分子带有大小不同的插入片段。 由于高等真核生物的基因组庞大，按一般载体承受外源DNA插入能力（大约为1000~3000bp）计算，能产生几十万个大小不同的DNA片段，形成由几十万个大小不同的重组体分子组成的克隆群体。 5. 4. 2 重组体DNA分子的构建 1.外源DNA片段定向插入载体分子 用两种不同的限制性核酸内切酶同时消化特定的DNA分子，将产生不同