第五章分子生物学研究法(上)2讲课.ppt

分子生物学基本研究法（上）DNA、RNA及蛋白质操作技术 5.3 RNA基本操作技术 5.3.1 总RNA的提取 5.3.2 mRNA的纯化 5.3.3 cDNA的合成 5.3.4 cDNA文库的构建 5.3.5 基因文库的筛选 5.3.1 总RNA的提取 细胞中的总RNA包括： mRNA 1%~5% rRNA 80%~85% tRNA sRNA RNA的抽提方法 1.实验室常用方法：异硫氰酸胍－苯酚抽提法 Trizol试剂：苯酚和异硫氰酸胍组成，可迅速破坏细胞结构，释放细胞质及细胞核中的RNA，并使核糖体蛋白与RNA分子分离，还能保证RNA的完整。 Trizol提取步骤：首先在液氮中研磨材料，匀浆，加入trizol试剂，再加入氯仿抽提，分离水相，异丙醇沉淀。 2. 硅胶膜纯化柱法 将含有目的RNA的细胞破碎液通过该柱，RNA吸附在硅胶膜上，然后在低盐浓度下可从硅胶上直接洗脱RNA。 RNA的浓度和纯度的判断： 可通过测定其OD260和OD280 OD260＝1时，相当于浓度为40μg/mL，当OD260/OD280＝1.8～2.0时，说明RNA纯度较好。 5.32. mRNA的纯化 寡聚（dT）－纤维素柱色谱法： 利用mRNA3’端含有PolyA+的特点，当RNA流经寡聚dT纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异性地结合在柱上，再用低盐溶液或蒸馏水洗脱mRNA。经过两次此柱可得到较高纯度的mRNA. Promega PolyAT tract mRNA 分离系统分离多聚(A)mRNA。将用生物素标记的寡聚(dT)引物与细胞总RNA共温育，加入与微磁球相连的抗生物素蛋白，用磁场吸附通过寡聚(dT)引物与抗生物素蛋白及强力微磁球相连的mRNA。 5.3.3 cDNA的合成 cDNA（complementary DNA）：在体外以mRNA为模板，利用反转录酶和DNA聚合酶合成的一段双链DNA。 5.3.4 cDNA文库的构建 cDNA文库：是指将某种生物体基因组转录的全部mRNA经反转录产生的cDNA片段分别与克隆载体重组，储存于某种受体菌中，该群体就称该生物基因组的cDNA文库。 构建cDNA文库的基本程序： ①mRNA的提取和纯化。 ②合成cDNA第一链。 ③将mRNA-cDNA杂交分子转变为双链cDNA分子。 ④将双链cDNA重组到噬菌体载体或质粒载体上。 ⑤将重组子体外包装成具有感染力的噬菌体颗粒导入到大肠杆菌寄主细胞中增殖。 基因组文库与cDNA文库的差别 基因组文库中包含了所有基因，而cDNA文库只包含表达的基因，缺乏内含子和调控序列，在研究基因结构时用处不大 cDNA文库代表了mRNA的来源，转录本在丰度上有差别，而基因组文库在理论上均等地代表了所有基因序列 不同细胞类型制备的cDNA文库包含一些共同序列和独特序列，可用于分离差别表达的基因，基因组文库中不能 基因组文库由于含有不表达序列，比cDNA文库大 mRNA在不同组织之间存在丰度差异，因此cDNA文库在构建时对于mRNA含量较少的就比较困难，而基因组文库不存在这样的问题 5.3.5 基因文库的筛选 基因文库的筛选是指通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需重组DNA分子的特定克隆过程。 5.3.5.1 核酸杂交法 5.3.5.2 PCR筛选法 前提：已知足够的序列信息并获得基因特异性引物。 步骤：（1）将文库保存在多孔培养板上 （2）用设计好的目的基因探针对每个孔进行PCR筛选，鉴定出阳性孔 （3）把阳性孔中的克隆稀释到次级多孔板中进行PCR筛选。 （4）重复以上程序，直至鉴定出与目的基因对应的单个克隆为止。 5.3.5.3 免疫筛选法 原理：抗原抗体特异性结合 适用于对表达文库的筛选 5.4 SNP的理论与应用 SNP的定义 定义：单核苷酸多态性 ( single nucleotide polymorphism，SNP) 主要是指在基因组DNA序列中由于单个核苷酸的突变而引起的多态性。 是第三代遗传标记。 5.4.1 SNP概述 单倍型：是指位于染色体上某一区域的一组相关联的SNP等位位点。 SNP分类： cSNP 同义cSNP 非同义cSNP