分子生物学研究法.ppt
當靶DNA與標記探針形成G-T或G-A末端堿基錯配的雙鏈體時,檢測有一定難度。寡核苷酸探針越短,堿基錯配造成的去穩定效應越明顯,較易與完全的雙鏈體分子相區分。但是,探針短,雜交產物的總體穩定性下降,信/噪比下降,影響結果的可靠性。所以,6-mer寡核苷酸矩陣晶片只能用於測定500bp的靶DNA;7-mer=2000bp,8-mer=8000bp。SBH的應用:
①可有效檢測靶DNA中的單堿基突變;
②可用於不同DNA片段之間的序列比較;
③可用於檢測不同生長發育狀態下細胞中特定基因的表達狀況;
④可用於檢驗傳統測序技術的準確性。5.基因的定點誘變(site-directedmutagenesis)???使已克隆基因或DNA片段中的任何一個特定堿基發生取代、插入或缺失變化的過程叫作基因的定點誘變,是基因工程和蛋白質工程的重要手段。a.盒式誘變(cassettemutagenesis),包括盒式取代誘變和混合寡核苷酸誘變兩種方式。b.寡核苷酸引物誘變??應用化學合成的含有突變堿基的寡核苷酸短片段做引物,進行DNA複製,使寡核苷酸引物成為新合成的DNA子鏈的一個部分。C.PCRG與PCR誘變6.利用DNA與蛋白質的相互作用進行核酸研究.a.凝膠滯緩實驗(Gelretardationassay),又稱DNA遷移率變化試驗(DNAmobilityshiftassay--EMSA)。b.DNaseI印跡試驗(DNaseIfootprinting)主要步驟:
①用32P標記DNA雙鏈末端,並用RE切去一端;
②加入細胞特定週期蛋白質提取物,溫育;
③加入適量DNaseI或硫酸二甲酯-六氫吡啶,使DNA鏈發生斷裂。
這一反應中,DNaseI或硫酸二甲酯的用量非常關鍵,要保證一條鏈只發生一次斷裂!
④沉澱DNA(包括與DNA相結合的蛋白質);
⑤進行DNA凝膠分析。??如果某個蛋白質已經與DNA的特定區段相結合,那麼,它就會保證該區段DNA免受消化或降解作用。在電泳凝膠的放射自顯影圖片上,相應於蛋白質結合的部位不產生放射性標記的條帶。c.甲基化干擾試驗(Methylationinterferenceassay)??用DMS處理靶DNA,使平均每條鏈上只有一個G被甲基化。將局部甲基化的DNA與含DNA結合蛋白的細胞提取物共溫育後進行凝膠滯緩試驗。分離各種DNA條帶,並用六氫吡啶切割甲基化的殘基。如果因某個G殘基的甲基化作用而阻止了蛋白質與DNA的結合,那麼,六氫吡啶對這個甲基化G殘基的切割作用,就只能在沒有蛋白質結合的DNA中觀察到。d.體內足跡試驗?用適量DMS處理完整的游離細胞,使染色質中的G殘基甲基化,提取DNA並加入六氫吡啶切割DNA鏈。與對照的裸露DNA經甲基化處理後形成的梯度相對照,就能發現DNA鏈上的蛋白質結合區。三、分子克隆技術1、高質量mRNA的製備??應用PromegaPolyATtractmRNAIsolationSystem分離Poly(A)RNA。將BiotinylatedOligo(dT)引物與細胞總RNA共溫育,加入與微磁球相連的Streptavidin,用磁場吸附與PMP相連的SA-BiotinylatedOligo(dT)-mRNA。2.反轉錄成cDNA可同時在反轉錄系統中加入Oligo(dT)12-18-mer及隨機引物R6,以保證得到全長cDNA;
應選用活性較高的反轉錄酶(Reversetranscriptase);
應選用甲基化dCTP;
應保證所獲得雙鏈cDNA的方向性。SuperScriptChoicecDNA合成系統中所用的poly(dT)引物因為絕大多數大腸桿菌細胞都會切除帶有5‘-methylC的外源DNA,所以,應選用mcrA-mcrB-菌株。3.分子克隆的主要方法(1)構建cDNA、核DNA文庫,應用現有核酸探針分離新的目的基因;
(2)差式雜交(differentialscreen)和扣除雜交(subtractivehybridization)技術;
(3)DD-RT-PCR法及差別顯示技術;
(4)差別分析法(RDA法,即Representationaldifferenceanalysis);
(5)酵母雙雜交體系Two-hybridsystem;
(6)圖位克隆法(map-basedcloning)與染色體步移(genomicDNAWalking)。?習慣上,人們用克隆表示由同一物種具有相同基因型的兩個或多個個體組成的群體。所以,從同一受精卵分