酶与蛋白质工程第4章基因表达与蛋白质分离纯化教程.ppt

第四讲 基因表达与蛋白质分离纯化 Escherichia coli E.coli常与一些食源性疾病有关，但从人体肠道内分离出来的两种命名为K-12和B的良性大肠杆菌菌株却是两种重要实验用菌株。大肠杆菌K-12的基因组的测序工作已于1997年完成。大肠杆菌B菌株自1918年被分离出来后，在1959年被分离为两类实验用菌株：REL606和BL21(DE3)，后者在医学和工业上用于生产蛋白质 由美国、韩国和法国的科学家组成的研究小组完成了对两种实验室常用的大肠杆菌(E.coli)菌株基因组的测序工作，发表在《Journal of Molecular Biology》 (2009) 基因组大小4.6M bp 载体分类 克隆载体：携带插入外源片段的质粒或噬菌体 表达载体：就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、终止子等），使目的基因能够表达的载体 （１）复制起始点 （２）选择性基因（一般为抗生素抗性基因） （３）强的、可诱导的启动子 （４）强的转录终止序列 （５）核糖体结合位点 （６）合适的多克隆位点 基因的融合 采用DNA重组技术将不同基因或基因片段融合，经合适的表达系统表达后，可获得由不同功能蛋白拼合在一起而形成的新型多功能蛋白 构建融合蛋白的基本原则：将第一个蛋白基因的终止密码子删除，再接上带有终止密码子的第二个蛋白或多肽基因，即可实现两个基因的融合表达 为蛋白质的表达和纯化提供方便 蛋白质结构和功能的研究 获得蛋白质的途径（通过体外切割） 与其它不同功能的蛋白质融合，产生新的多功能蛋白 与报告分子共表达，研究蛋白定位及转基因表达 防止外源蛋白被宿主的蛋白水解酶降解 改变胞内溶解性：硫氧还蛋白，GST 蛋白表达的空间定位：信号肽 基因融合的策略 基因融合的方式 信号肽+基因 信号肽+基因+插入序列 若使用的linker较长，由于在重组蛋白的生产过程中对蛋白裂解比较敏感，可能会导致融合蛋白产量的降低；同时又涉及免疫原性的问题，因接头序列本身就是新的抗原 应用较短的linker虽可克服蛋白酶分解的问题，但可能使两个大分子相距最近，影响两种蛋白高级结构的折叠，从而相互干扰，导致蛋白功能丧失，linker序列的组成对融合蛋白的折叠有重大影响 另外，在设计linker序列时，尽量避免二级结构的产生，linker中常见的氨基酸是非极性的疏水氨基酸（Gly、Ser等） 蛋白纯化 蛋白质的检测和定向固定 提高重组蛋白质的产量 增强重组蛋白质的可溶性及稳定性 各种融合蛋白表达载体 融合蛋白报告分子 将易于检测的蛋白质与目的分子融合表达，可显示目标分子的存在和定位，广泛应用于启动子分析、监控转基因及其表达、细胞的信号转导与药物的筛选 1. 启动子结构对表达效率的影响 　　 转录起始的速率是基因表达的主要限速步骤，因此要选择强的可诱导的启动子及相关的调控序列 ① mRNA的稳定性：细胞内mRNA的浓度由mRNA转录的速率和mRNA降解之差来决定； ② 翻译的起始：无效的翻译起始多半是蛋白质低表达的最常见问题； ③ 翻译的延伸：遗传密码的简并； ④ 氨基酸的错误搀入； ⑤ 翻译的终止 每种生物对简并密码子的使用频率的差异； 同义密码子的使用频率与相应的tRNA含量相关； 某些密码子对所有不同基因都是最常用的，如CCG是脯氨酸最常用密码子； 富含宿主不常用密码子的外源基因有可能得不到有效表达 大肠杆菌细胞学结构特点使表达的外源蛋白可能定位在胞内、胞质膜、胞周质、外膜、胞外培养基 （1）胞内表达：小分子蛋白易表达、易水解。大分子蛋白，胞内表达易形成包涵体 （3）细胞外分泌：利用已有的“真正”的分泌蛋白所采用的途径；利用信号肽序列、融合伴侣和具有穿透能力的因子。分泌至培养基的蛋白容易纯化，减少内源蛋白酶降解 菌株内蛋白酶太多会导致外源蛋白表达产物不稳定，选用蛋白酶缺失的宿主菌 真核基因在原核细胞中表达及调控 真核基因特点： 启动子不能被原核识别； mRNA上没有SD序列； 基因内部含内含子； 产物往往需要翻译后加工； 易被原核酶系降解 因此，在原核细胞中表达时应注意三个问题： 基因编码区必须连续； 必须置于原核启动子、终止子和SD序列的控制之下； 产生的mRNA必须相对稳定并能有效进行翻译和蛋白质折叠 Yeast 芽殖是酵母最常见的无性繁殖方式，即从细胞壁上产生芽体，形成子细胞。酿酒酵母于1996年完成基因组测序 芽殖酵母和裂殖酵母听起来是近亲，但实际上它们在约３亿到４亿年前就分家了，走上不同进化道路。2001年诺贝尔生理学或医学奖获得者、英国帝国癌症研究基金会的保罗·纳斯领导的小组完成裂殖酵母基因组测序工作，发表在《Nature》杂志上 裂殖酵母的基因组含有3条较大的染色体，约1380万个碱基