放射免疫分析技术课件.ppt

放射免疫分析技術（Radioimmunoassay，RIA）核醫學治療：腫瘤、甲亢等診斷體內——PET、SPECT、放射免疫成像等體外——放射免疫分析（RIA）標記免疫分析技術用標記示蹤技術觀察抗原抗體一級反應的分析方法特點：敏感性高，反應時間短，可用儀器檢測結果三大標記免疫分析技術：放射免疫、螢光免疫、酶免疫檢測方法檢測範圍生化、常規免疫mg~μg（10-3~10-6g）螢光免疫、酶免疫μg~ng（10-6~10-9g）放射免疫、發光免疫ng~pg（10-9~10-12g）PCRpg~fg（10-12~10-15g）一、放射免疫分析技術（Radioimmunoassay，RIA）女科學家R.Yalow（美,1921~）1950’末發明（胰島素），1977年獲諾貝爾醫學獎1.基本原理（1）競爭結合分析：Ag+Ab?AgAb*Ag+Ab?*AgAb（2）IRMA（免疫放射分析）：2.常用標記核素：（1）125I：γ射線，半衰期60天（2）3H：β射線，半衰期12.3年3.測量儀器（1）γ計數儀（2）β液閃儀4.基本試劑（1）標準品與質控品a.意義：放射免疫定量分析的尺度、品質控制的依據b.要求：化學結構上——與待測物有相同的化學結構化學純度上——對競爭反應有干擾的雜質的含量低含量準確注意不變質與降解：在運輸、保存時尤應注意；注意有效期c.種類：國際標準、國家標準、企業標準（2）標記物a.對標記物的要求比活度高：即單位物質的放射性強度高生物活性及免疫活性與標記前改變小放射化學純度高：應95%穩定性好：標記的同位素不易脫落b.標記方法：氯胺-T法：最常用的125I標記法，I與酪氨酸共價結合，方法簡便，但易造成蛋白質的損傷乳過氧化酶法：Iodogen（氯甘脲）法：固相法，標記率較高，損傷小，反應時間長置換法：3H最常用c.標記產物的純化：常用Sephadex層析，也可用矽膠G薄板層析或HPLC分離d.標記產物的鑒定：常用RIA法最大結合百分率標準曲線比較法e.半抗原的標記：必須先連接載體，常用牛血清白蛋白（BSA），再對載體作標記（3）特異性結合抗體a.對特異性結合抗體的要求：親和力（affinity）高：指單個抗體分子與抗原決定簇特異結合的能力，用K值表示，反映靈敏度特異性高：與待測抗原的結合力高，而與待測抗原類似物的結合能力（交叉反應）低滴度（效價）高：指結合50%標記抗原時抗體的稀釋度高穩定性好：能長期保存，化學性質、效價穩定b.抗體的製備選擇合適的免疫動物：兔、鼠、羊應用佐劑：福氏完全佐劑與不完全佐劑（羊毛脂、石蠟油+卡介苗）選擇合適的免疫方法：劑量、接種途徑（腹股溝、腋窩、脊柱兩側皮內多點）、間隔時間（加強）與次數c.抗體的純化去除雜抗體：用抗原吸附法提取特異性IgG：先用鹽析法粗提，再用離子交換層析或親和層析純化d.抗體的鑒定鑒定內容：效價、親和力、特異性鑒定方法：效價（瓊脂單擴）、特異性（瓊脂雙擴）、RIAe.單克隆抗體的使用：用於IRMA或RIA，特異性高不一定優於傳統的多克隆抗體5.競爭性放射免疫分析法的建立（1）反應方式a.平衡法：標記抗原與待測抗原、特異性抗體同時加入溫育b.順序法：先加入待測抗原、特異性抗體溫育一段時間後再加入標記抗原。可提高反應靈敏度c.STAT法：反應未達平衡時即測定，較難控制反應條件（2）反應體系a.緩衝液：常用0.05~0.1mol/