第06章-放射免疫技术.ppt

免疫标记技术将抗原抗体反应与标记技术相结合，将已知的抗体或抗原标记上示踪物质（如酶、荧光素、放射性核素、胶体金及化学发光物质等），通过检测标记物，间接测定抗原抗体复合物的一类试验方法。常用的免疫标记技术免疫酶测定法免疫荧光技术放射免疫测定法化学发光免疫分析技术免疫胶体金技术免疫印记技术酶联免疫吸附试验（ELISA）免疫组化技术免疫荧光技术化学发光免疫技术免疫胶体金技术免疫印迹技术第一节

放射性核素及标记物制备125I优点：化学性质活泼，标记方法简单，核素丰度高产生γ射线，用普通的γ计数仪检测即可，并且测量的效率高半衰期60天，易于废料处理125I缺点：标记时以I代替蛋白上的H原子，改变抗原结构，影响抗原免疫学活性三、放射性标记物的鉴定（二）比放射性（放射性比度）单位质量标记物中所含的放射性强度（每分子被标记物平均所结合放射性原子的数目）单位：Ci/gmCi/mgCi/mmol比放射性过高，可提高方法的灵敏度，但过高将影响标记物免疫活性。计算法：依据标记反应中放射性核素的利用率（标记率）来计算标记物的比放射性（结果欠精确）。四、放射性标记物检测第二抗体法：加入第二抗体，但由于一抗含量少，形成的抗原-抗体1-抗体2这样的复合物少，因此同时要加入与一抗同种动物的血清或IgG，形成较大的复合物易于分离。优点：特异性好，稳定，非特异性结合低。缺点：抗体用量大，费用高聚乙二醇（PEG）沉淀法：非特异性沉淀较多，不沉淀小分子抗原。优点：便宜。缺点：受环境因素影响大。PR试剂法：结合第二抗体法和PEG法。用γ-计数仪分别测量各管沉淀物（B）的放射性强度，放射性计数（cpm）表示。以第1管的cpm值为B0，分别计数B/B0以B/B0为纵坐标，不同浓度胰岛素标准品为横坐标绘制标准曲线。估计待测管的B/B0，从标准曲线中即查到相应的胰岛素含量。优点：灵敏度高特异性强应用范围广：目前已经建立300多种生物活性物质的RIA检测，如肿瘤抗原、药物（地高辛等）寄生虫、病毒抗原、激素等。操作简便：有试剂盒、一次能分析大量样本、标本用量少。缺点：具有放射性和污染等问题。灵敏度受方法工作原理的限制，对体内某些含量特别低的物质尚不能检测。RIA是竞争性反应，被测物和标准物都不能全部参与反应，测定的值是相对而非绝对。放射免疫分析技术的灵敏度高、特异性强、精密度好,常用于各种激素、微量蛋白质、肿瘤标志物和药物等微量物质的测定。但由于放射污染和危害，常用核素半衰期短，试剂盒稳定期不长等诸多不足,RIA将逐渐被取代。小结RIA和IRMA的原理及区别125I作为免疫分析标记物的优点胰岛素RIA测定方法混匀，370C半小时标准品（μU/mL）检测管01020408016012试管号123456标准品100100100100100100100待测血清100抗血清（一抗，限量）100100100100100100100100正常兔血清100100100100100100100100混匀，370C1小时125I-胰岛素（定量）100100100100100100100100第二抗体10010010010010010010010078第三节免疫放射分析一、免疫放射分析－基本原理以过量的标记抗体（125I）与待测抗原进行非竞争性免疫结合反应,用固相免疫吸附剂对B或F进行分离，其灵敏度和可测范围均优于RIA操作也较RIA简单。①先用过量标记抗体与待测抗原进行反应，形成抗原抗体复合物；②用固相抗原结合未结合的标记抗体并将其分离；③测定上清液的放射量125I标记抗体待测抗原（标本）包被于固相的抗原（检测抗原）单位点IRMA①先用固相抗体与抗原结合②再用过量的标记抗体与抗原的另一决定簇结合，形成固相抗体-抗原-标记抗体复合物；③洗弃剩余的标记抗体，测固相的放射性。125I标记抗体待测抗原（标本）包被于固相的抗体（双抗体夹心测抗原）双位点IRMARIA与IRMA的比较放射免疫分析免疫放射分析标记物反应模式测量范围抗体用量分离技术反应时间敏感度应用范围抗原抗体限量过量竞争性分析非竞争性分析较慢较快PEG-双抗体法固相吸附法较窄较宽常用于小分子抗原较高较低常用于大分子抗原或抗体RIA和IR