生物化学：蛋白质的重要性质及分离纯化.ppt

第四节：蛋白质的重要性质及分离纯化ReleaseproteinsfromcellsandDifferentialcentrifugationasafirststepinproteinpurification蛋白质与aa一样，能够发生两性解离，也有等电点。在等电点时(IsoelectricpointpI)，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。★等电点测定等电聚焦法（isoelectricfocusing）一、蛋白质的性质（1）蛋白质的两性解离蛋白质的分子量很大（1-100nm），在水溶液中具有胶体性质，如布郎运动、丁达尔现象不能通过半透膜等。透析：将含小分子杂质的蛋白质放入透析袋，置水中，小分子杂质不断从袋中出来，大分子蛋白质仍留在袋中。半透膜：只允许小分子通过，而大分子不能通过。如羊皮纸、火棉胶、玻璃纸等。（2）蛋白质的胶体性质稳定蛋白质胶体溶液的主要因素：A.蛋白质表面极性基团形成水化膜。B.非等电状态时，同种电荷的互相排斥。蛋白质在溶液中靠水膜和电荷保持其稳定性，水膜和电荷一旦除去，蛋白质溶液的稳定性就被破坏，蛋白质就会从溶液中沉淀下来，此现象即为蛋白质的沉淀作用。（3）蛋白质的沉淀作用在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从溶液中沉淀分离,沉淀过程中，蛋白质结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，故这种沉淀又称为非变性沉淀或可逆沉淀。可逆沉淀的方法:等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。可逆沉淀由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀或不可逆沉淀。如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀（Hg2+、Pb2+、Cu2+、Ag2+）和生物碱试剂或某些酸类沉淀等都属于不可逆沉淀。不可逆沉淀天然蛋白质因受物理、化学因素的影响，使蛋白质分子的构象发生了异常变化，从而导致生物活性的丧失。这种现象称为蛋白质的变性(denaturation)。（4）蛋白质的变性a.蛋白质的变性蛋白质变性后的现象：①结晶及生物活性丧失。②疏水侧链基团外露，分子结构伸展松散。③理化性质改变，溶解度降低，沉淀，粘度增加。④生物化学性质改变，易被蛋白酶水解。b.引起蛋白质变性的主要因素：温度（热、冷）强酸、强碱尿素和盐酸胍的影响（破坏分子内部氢键、破坏疏水效应）H2N-C-NH2H2N-C-NH2+Cl-表面活性剂的影响：如十二烷基硫酸钠（SDS）CH3-（CH2）10-CH2-O-S-O-.Na+（1.4gSDS/1g蛋白）ONH2ooc.蛋白质的复性当变性因素除去后，变性蛋白质又可恢复到天然构象，这一现象称为蛋白质的复性（renaturation）。Trp、Tyr和Phe在280nm附近有最大吸收。因此，利用这个性质，可以对蛋白质进行定性鉴定和定量测定。（5）蛋白质的紫外吸收二、分离纯化蛋白质的主要方法（一）根据溶解度差异分离：选择性沉淀法等电点沉淀法盐析法有机溶剂沉淀法（二）、根据分子大小和形状的差异分离①透析和超滤法：除去小分子物质半透膜阻留pr分子，而让小的溶质分子和水通过，以达到除去蛋白质溶液中小分子（盐、低分子酸等）。施以一定的压力使小分子溶质通过一半透膜，而按半透膜的筛孔大小截留相应的蛋白质分子沉降的速度与颗粒的大小和密度有关。离心后按其沉降的速度不同，彼此分开形成区带。再进行光学定位，针刺或冰冻切片采样分析②密度梯度离心法凝胶过滤层析的原理:介质：交联葡聚糖（Sephadex）;聚丙烯酰胺凝胶（Bio-GelP，）琼脂糖凝胶（Sepharose，Bio-GelA）③凝胶过滤法（三）根据电荷性质的差异分离1、电泳和等电聚焦法：普通电泳、等电聚焦、双向电泳、脉冲电泳、毛细管电泳装置：圆盘电泳（柱状）、水平板电泳、垂直板电泳。支持物： PAGE、琼脂糖胶等）PolyacrylamideGelElectrophoresis(PAGE)Moleculesareseparatedbysizeandchargeinanelectricfield.