生物方法 技术 试剂蛋白质分离与纯化----高效液相色谱分离技术.pdf

蛋白质分离与纯化

高效液相色谱分离技术

张祥民

复旦大学生物医学研究院

2011.11.19.

Waters

ACQUITYUPLC®系统

纳升级超高效液相色谱nanoACQUITY

®®

UltraPerformanceLC(UPLC)系统

Waters

ACQUITYUPLC®系统

系统的工作压力为10,000psi，允许使用小于2微米

颗粒填料的长柱子进行超高峰容量分离。整个系

统非常适合在精确纳升流速基础上进行高分辨率

鉴定及2D-LC分离。

纳升流速范围：不分流的流速，为200

nL/min-100µL/min

nanoACQUITYUPLC柱：内径为75µL-1mm

-长为100mm-250mm

JournalofChromatographyB,877(2009)3045–3053

ShimadzuLaunchesNexera,UltraHigh-

PerformanceLiquidChromatograph

DeliversHigh-SpeedandHigh-ResolutionAnalysis

withExcellentDataQuality

Shimadzu’sNexeraisoptimizedto

enableanalysisatpressuresupto130

MPa.

典型液相色谱最基本构成

并联、串联结构

双泵头恒流输出

示意图

活塞泵与单向阀结构示意图

四元溶剂梯度系统示意图

Agilent1100毛细管液相色谱二元溶剂高压

混合微流泵结构示意图

Micro-HPLC部分

HPLCColumnTechnologies

•OrdinaryHPLCColumn

–Packingmaterial,10,7,5,4,3micronporous,spherical

–ODS,Chemicalbondedfunctonalgroup,Cation/Anion

exchange

–Columndiameter,4.6mm

•PreparativeLCColumn

–Packingmaterial,10-50micron

–Columnsize,10mm-500cm

•Micro/nanoHPLCcolumn

–Packings,5-1.5micron

–20-1000micron

HPLC色谱柱

•常规柱：4.6mmidx15cm

5/10/15/20/25cm

•细管径柱：0.5mm/1mm/2mm

•毛细管柱、nanoLC柱：50/75/100umid.

•制备柱：1-5cm、10-100cm工业制备

HPLC填料—球形、多孔结构

HPLC填料：3、5、7、10微米直径，制备20-50微米;

UPLC填料：1.5、1.7、2微米。

分离蛋白质填料：微孔30nm,普通填料8-12nm.

HPLC紫外-可见检测器的光路结构示意图

PAD检测器的结构原理图

HPLC仪器使用技术要点

•溶剂彻底过滤（0.4um滤膜水、有机相）

•水隔天更换，或加入5%乙腈，0.001%NaN3

•溶剂脱气：He，超声，在线真空

•样品处理：离心过滤，A相溶解过滤

•使用预柱

•pH控制：2.5-8

o

•色谱柱温度：25