蛋白质分离纯化主要方法.ppt

**+待纯化分子配体a.待纯化分子和配体间具有亲和性+基质b.活性基质与配体结合产生亲和吸附剂++杂质c.待纯化分子与亲和吸附剂结合，与杂质分离+d.偶联复合物经解离后，得到纯的待纯化分子配体L基质M待分离物质SL-S复合物第31页，共75页，星期日，2025年，2月5日**第32页，共75页，星期日，2025年，2月5日**应用分离纯化酶、抗原、抗体分离纯化核酸研究酶的结构与功能基质纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、sepharose、sephadex第33页，共75页，星期日，2025年，2月5日**聚焦层析（Chromatofocusing）该法是在等电点聚焦方法基础上发展起来的，其分离纯化蛋白质的依据是等电点的差异和离子交换行为。蛋白质按其等电点在pH梯度环境中进行排列的过程叫做聚焦效应。原理第34页，共75页，星期日，2025年，2月5日**pH梯度的形成(由多缓冲剂和多缓冲交换剂形成)是聚焦效应的先决条件，如果一种蛋白质加到已形成pH梯度的层析柱上时，由于洗脱液的连续流动，蛋白质将迅速地迁移到与它等电点相同的pH处。从此位置开始，该蛋白质将以缓慢的速度进行吸附、解吸附，直到在等电点pH时被洗出。在聚焦层析过程中，一种样品分次加入时，只要先加入者尚未洗出，并且有一定的时间进行聚焦，剩余样品还可以加到柱上，其聚焦过程都能顺利完成。第35页，共75页，星期日，2025年，2月5日**1、pH梯度的形成2、蛋白质行为3、聚焦效应第36页，共75页，星期日，2025年，2月5日**层析时的聚焦效应示意图pH梯度溶液的形成示意图蛋白质1（pI=7）蛋白质2（pI=8）流速移动速率第37页，共75页，星期日，2025年，2月5日**几种主要层析方法比较第38页，共75页，星期日，2025年，2月5日**二、电泳技术

电泳的一般原理电泳技术的分类电泳的影响因素常用电泳技术第39页，共75页，星期日，2025年，2月5日**电泳的一般原理

电泳是带电颗粒在电场作用下向着与其电荷相反的电极移动的现象。许多生物分子都带有电荷，其电荷的多少取决于分子组成、性质及其所在介质的pH。如果混合物中各组分的结构组成不同，在某一pH溶液中，各组分所带电荷性质、电荷数量不同，加之其分子量不同，在同一电场的作用下，各组分泳动的方向和速度也各异，而达到分离鉴定各组分的目的。第40页，共75页，星期日，2025年，2月5日**电泳分类（一）按原理分四种1.区带电泳：是当前应用最为广泛的电泳技术。

2.自由界面电泳：这是瑞典Uppsala大学的著名科学家Tiselius最早建立的电泳技术，是在Ｕ形管中进行电泳，无支持介质，因而分离效果差，现已被其他电泳技术所取代。

3.等速电泳：需使用专用电泳仪，当电泳达到平衡后，各电泳区带相随，分成清晰的界面，并以等速向前运动。

4.等电聚焦电泳：由两性电解质在电场中自动形成pH梯度，当被分离的生物大分子移动到各自等电点的pH处聚集成很窄的区带。第41页，共75页，星期日，2025年，2月5日**（二）按支持介质的不同可分为：

1.纸电泳

2.醋酸纤维薄膜电泳3.琼脂凝胶电泳4.聚丙烯酰胺凝胶电泳

5.SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）。第42页，共75页，星期日，2025年，2月5日**（三）按支持介质形状不同1.薄层电泳；?2.板电泳；??3.柱电泳。（四）按用途不同可分为：

1.分析电泳；2.制备电泳；?3.定量免疫电泳；第43页，共75页，星期日，2025年，2月5日**（五）按所用电压不同可分为：

1.低压电泳：100V～500V，电泳时间较长，适于分离蛋白质等生物大分子。

2.高压电泳：1000V～5000V，电泳时间短，有时只需几分钟，多用于氨基酸、多肽、核苷酸和糖类等小分子物质的分离。（六）按pH的连续性不同可分为：1.连续pH电泳：如纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳；2.非连续pH电泳：如聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳；第44页，共75页，星期日，2025年，2月5日**电泳技术分类（按实验装置分类）

纸电泳薄膜电泳凝胶电泳