蛋白质分离纯化技术.ppt

液固吸附色谱法（adsorptionchromatography）离子交换色谱法（IEC）空间排阻色谱法（SEC）液液分配色谱法（partitionchromatography）按分离机制的不同分为四类：高效液相色谱的主要类型饱和烃烯芳烃醚醛酮酸极性较小组分，吸附力较弱，容易解吸，先流出。非离子型化合物的分离，常用于分离同分异构体。流动相：有机溶剂极性较大组分滞留作用大，后流出。各组分的出峰顺序适用于分离分子量200-1000的组分，大多数用于固定相：吸附剂为硅胶或氧化铝，粒度5-10μm液固吸附色谱法液固吸附色谱分离机理分离过程是一个吸附——脱附的平衡过程。01将特定的液态物质涂于担体表面化学键合于担体表面而形成的有机键合层，如C18（十八烷基硅烷）、C8（辛烷基）、氨基键合硅胶——常用固定相02极性固定相：正相色谱非极性固定相：反相色谱固定相类型液液分配色谱液液分配色谱正相色谱法反相色谱法1.极性固定相聚乙二醇、氨基与腈基键合相2.相对非极性流动相正已烷、环已烷3.极性调节剂???乙醇、四氢呋喃、三氯甲烷4.分离中等极性和极性较强化合物.???酚类、胺类、羰基类及氨基酸类5.组分流出顺序极性小先洗出1.非极性固定相C18（简称ODS）、C82.极性流动相水或缓冲液3.极性调节剂???甲醇、乙腈、四氢呋喃4.分离非极性和极性较弱化合物占整个HPLC应用的80%左右5.组分流出顺序极性大先洗出固定相：离子交换树脂，常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架，在表面未端芳环上接上羧基、磺酸基构成阳离子交换树脂1在表面未端芳环上接上季胺基构成阴离子交换树脂2流动相：电解质溶液、有机弱酸或有机弱酸盐溶液3离子交换色谱法树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的离子进行可逆交换而分离。分离原理离子交换色谱法主要用于分析阴，阳离子，凡是在溶剂中能够电离的物质通常都可以用离子交换色谱法来进行分离。应用有机酸、氨基酸、多肽及核酸。分析物质离子交换色谱法分离机理以凝胶(gel)为固定相。它类似于分子筛，但凝胶的孔径比分子筛要大得多。1小分子量的化合物可以进入孔中，滞留时间长；大分子量的化合物不能进入孔中，直接随流动相流出。2常用于分离高分子化合物，如组织提取物、多肽、蛋白质、核酸等。3凝胶色谱：（分子排阻色谱法）凝胶色谱分离机理对蛋白质、核酸、氨基酸、生物碱、类固醇和类脂等尤为有利。02具有气相层析的全部优点。由于HPLC分离能力强，测定灵敏度高，选择性高，分析速度快，可在室温下进行，故应用范围极广，无论是极性还是非极性，小分子还是大分子，热稳定还是不稳定的化合物均可用此法测定。01HPLC的特点蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术,称为电泳(electrophoresis)。01pHpI蛋白质带负电荷，电泳中向正极移动02pHpI蛋白质带正电荷，电泳中向负极移动03pH=pI蛋白质净电荷为零，电泳中不动04电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳支持物:单体丙稀酰胺(Acr)交联剂:甲叉(or亚甲)双丙稀酰胺(Bis)聚合光聚合:核黄素为催化剂(阳光,日光)制大孔胶化学聚合:过硫酸铵(NH4)2S2O3，缩写为APS为催化剂N,N,N’,N’,--四甲基乙二胺缩写为TEMED是加速剂用来制小孔胶聚合链长度:由Acr浓度决定交联程度:由Acr与Bis相对比例决定凝胶网孔大小：01如:AcrBisT(%)小孔28.0g0.735g7%大孔10.0g2.5g2.5%Bis的浓度低，孔径大，可在聚合前调节单体与Bis的浓度比02聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳常用于蛋白质分子量的测定。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamidegelelectrophoresis，SDS）：SDS（十二烷基磺酸钠）是一种阴离子型表面活性剂，它能够与蛋白质多肽链中的氨基酸残基按大约1?1.4比例结合。每一个蛋白质分子都因为结合了许多的SDS而带有大量的负电荷，而蛋白质分子原有的