EGFR(T790M)抑制剂的设计、合成及活性评价.docx

引言

肺癌是发病率和死亡人率最高的恶性肿瘤，源于其多药耐药性的层出不穷，5年存活率改善不大，维持在8%～14%，目前我国每年新发病的肺癌患者超过73万人，其中，非小细胞肺癌（NSCLC）占85%左右。据统计，超出50%的亚洲肺癌患者在治疗过程中发生标志物表皮生长因子受体（EGFR）基因突变，主要集中在18～21号外显子区域，包括18/19缺失、19/20插入、L858R、G719X等，其中，T790M突变尤为显著，占EGFR突变的60%以上。当前，针对EGFR突变所开发的靶向精准药物已经发展到了第三代，奥希替尼，尽管其对T790M耐药突变具有良好的治疗效果，但仍不可避免地出现C797S/R和L792F/H等突变现象。因此，接受EGFR靶向药物治疗的患者，需定期进行耐药检测以便及时调整用药方案。

2015年，研究中，指出泛激酶抑制剂依鲁替尼可以较为温和地抑制EGFR（T790M）突变的NSCLC细胞系的增殖，对H1975细胞的IC50为1.2?μmol/L。在前期研究中，针对依鲁替尼的高亲脂性（CLogP=4.07）、不良的水溶性和生物利用度，本课题组对其进行了结构优化，成功获得脂水分配系数改善的先导化合物B6（CLogP=2.55），实现体外对H1975细胞系的抗增殖活性和体内对H1975异植瘤抑制活性均优于依鲁替尼。为了确认化合物B6对H1975的作用活性来源，检测了其对EGFR（T790M）激酶的抑制活性，IC50为（22.0±2.6）nmol/L，低于其对其他激酶的抑制活性，并且优于依鲁替尼（IC50=（52.0±4.3）nmol/L）；同时使用Autodock软件对B6与EGFR（T790M）蛋白（PDB：5GNK）进行了对接分析，如下图所示，化合物B6不仅与该蛋白的Met793、Gln791残基形成氢键相互作用；其磺酰烯基也与Cys797形成了稳定的共价键，很好地解释了B6如何使EGFR（T790M）蛋白抑制失活。为了继续探索此类衍生物对EGFR（T790M）突变的NSCLC的治疗效果，挑选生物电子等排体1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺（依鲁替尼的母核）替换了B6的7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-胺，亚甲基四氢吡咯基团则选用同系物碎片（前期研究中所得的优势碎片）进行构效关系研究，如下图B所示，所合成的化合物均进行核磁共振（NMR）和质谱（MS）结构表征及体外生物活性确认。

正文部分

1?实验部分

1.1??主要仪器与试剂

1.2??中间体2的制备

1.3??（3-碘-1H-4-氨基吡唑[3,4-d]并嘧啶）（4）的制备

1.4??中间体5的制备

1.5??中间体6的制备

1.6??中间体7的制备

1.7??目标化合物的制备

1.8??目标化合物对EGFR、EGFR（T790M）激酶活性的测试

1.9??肺癌细胞系的抗增殖活性测试

1.10??化合物与EGFR（T790M）蛋白的对接分析

2?结果与讨论

2.1??目标化合物的波谱分析

目标化合物I1～I3和II1～II3的结构应用1HNMR、13CNMR和MS-ESI进行了表征，现以I1为例予以说明。根据1HNMR分析，化学位移δ?8.26，积分1个氢，单峰，为嘧啶环上的氢（-C4N2H-）；化学位移分别为7.69～7.64、7.46～7.43的两组多重峰，积分均为2个氢，为1,4-取代苯环上的两组对称的氢（-C6H4-）；化学位移δ7.22～7.18的多重峰，积分为5个氢，为单取代苯基上的氢（-C6H5）；化学位移δ6.88、6.18的两组dd峰分别来自烯键上的氢（-C2H3），前者积分1个氢，为端基烯碳C2的氢，后者积分2个氢，则为端基烯碳C1上的氢；化学位移δ4.86，ddd峰，积分1个氢，是4-取代哌啶基中次甲基碳上的氢（-C5NH9）；化学位移δ3.69（d）、2.96（td）、2.21（qd）、2.05（d）的峰，积分均为2个氢，分别为4-取代哌啶基中的4组亚甲基碳上的氢（-C5NH9）。从13CNMR可知，4-取代哌啶基的化学位移处于高场，其他碳原子出峰则位于低场，与化合物实验式相符。此外，再根据ESI-MS确定其分子量为476，确认其结构正确。

2.2??目标化合物的激酶活性分析

目标化合物对EGFR、EGFR（T790M）的激酶抑制活性如表1所示，取代基为苯氧基苯基取代者（I1～I3）的活性均明显优于胡椒环基取代者（II1～II3）。

2.3?目标化合物与EGFR（T790M）蛋白的相互作用分析

为了解释I和II系列化合物的构效关系，挑选了化合物I1和II1分别与EGFR（T790M）蛋白进行了共价对接分析。如下图a所示，两者均可与（T790M）蛋白的Gln791、Met793残基形成氢键，与Cys797形成共价键；不同的是，