抗菌肽BSN-37-MPX真核细胞表达、纯化及其抗菌作用研究.pdf

摘要

近年来，抗生素的滥用导致细菌产生耐药性，抗生素效果逐渐减弱，严重危

害着人类健康和畜牧业发展。在寻找抗生素替代品的过程中，发现抗菌肽具有抗

菌活性好、抗菌谱广、对细菌、病毒，寄生虫等生长具有抑制作用且具有免疫调

节作用。然而，抗菌肽的提取是制约其发展和应用的最大难题。首先，天然抗菌

肽的提取步骤繁琐并且得到的含量低；其次，化学合成的抗菌肽成本高、价格贵。

目前利用基因工程获得抗菌肽有着无可比拟的优势，体现在成本低、产量高和技

术成熟。本研究围绕抗菌肽MPX/BSN-37活性检测，体外表达和纯化串联基因

MPX和BSN-37，并研究其粗提物对小鼠免疫功能及体内的抗菌作用，具体工作

如下：

通过分别测定抗菌肽MPX、BSN-37活性和MIC，确定抗菌肽MPX、BSN-37、

MPX+BSN-37对大肠杆菌Y157最小抑菌浓度为12.5、25、25μg/mL。抗菌肽

MPX、BSN-37杀菌动力学研究结果表明，抗菌肽MPX在4h内具有良好的杀

菌活性；4×MIC条件下，1h后抗菌肽MPX与BSN-37联用能够显著降低活菌

数，且杀菌效果呈剂量依赖性增强。利用扫描电子显微镜进行细菌形态学观察，

发现细菌形态发生皱缩，细胞膜完整性被破坏：表明抗菌肽MPX和BSN-37联

用能够使细菌膜通透性增加，导致菌内容物外泄。以上结果表明，抗菌肽MPX

和BSN-37具有良好的体外杀菌活性。

为评估融合抗菌肽MPX/BSN-37的抗菌效果，构建融合蛋白的Vero细胞真

核表达系统。首先设计抗菌肽MPX和BSN-37串联，并在片段前面添加SUMO

大分子标签蛋白和后面与6×His标签相连接，合成后的核苷酸序列利用T4连接

酶将目的片段与线性化载体pcDNA3.1进行体外同源重组连接，成功构建了真核

表达载体pcDNA3.1-SUMO-MPX-BSN-37（简写：P14）和pcDNA3.1-SUMO(简

写：P0)。Vero细胞转染对照质粒pcDNA3.1-GFP，荧光下细胞呈现绿色，表明

转染方式可行，且转染效率较高。质粒P14和P0转染Vero细胞后，经Western-blot

检测，转染P14质粒的Vero细胞在28KD处有明显的条带，转染P0质粒的Vero

细胞在13KD处有明显的条带，说明串联抗菌肽成功在Vero细胞中表达。为了

确定目的蛋白最高表达量，筛选质粒最佳转染浓度，结果显示，质粒浓度低时，

I

P14的量与蛋白表达量呈正相关线性关系；转染质粒P14的量在2μg的时候，

蛋白表达量最高。综上，本研究成功构建真核表达载体P14，并在Vero细胞中

成功表达，且发现表达量在转染质粒的量在2μg时最高。

为探究粗提抗菌肽MPX/BSN-37对小鼠免疫功能的影响及小鼠经灌食粗提

抗菌肽后对大肠杆菌Y157的预防效果，本实验选取20g左右健康昆明小鼠，随

机分成7组，每组10只，即阴性对照组（NC），P0低剂量组（P01.5mg/mL），

P0中剂量组（P04.5mg/mL），P0高剂量组（P07.5mg/mL），P14低剂量组（P14

1.5mg/mL），P14中剂量组（P147.5mg/mL），P14高剂量组（P147.5mg/mL）

组。动物试验评价指标包括测定小鼠免疫器官指数；采用流式细胞术测定小鼠脾

脏中T淋巴细胞的百分数；分析小鼠肠道炎性相关因子。结果发现，高剂量组

7.5mg/mL粗提抗菌肽MPX/BSN-37能显著提高小鼠免疫器官指数，提高小鼠脾

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脏中CD3，CD4及CD8的T淋巴细胞总数及各亚群的百分比以及小鼠空肠中

炎性细胞因子IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ的水平。同时，免疫组化法发现灌胃粗

提抗菌肽后能提高小鼠空肠中巨噬细胞标记物F4/80、CD68的数量。以上结果

表明，高剂量组7.5mg/mL粗提抗菌肽MPX/BSN-37能明显提高小鼠免疫水平。

再者，小鼠经灌服粗提抗菌肽后腹腔注射大肠杆菌Y157，评估粗提抗菌肽体内

抗大肠杆菌感染效果。动物试验指标包括检测空肠菌落定植情况；肠道炎性因子；

肠道病理组织切片。结果表明，粗提抗菌肽在第三天时能够显著降低小鼠空肠菌

落定植数量，并且可降低大