第讲克隆基因的表达与产物纯化-外源基因在真核细胞中的表达.ppt
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克隆基因表达和产物纯化外源基因在原核细胞中表达.ppt
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外源基因在真核细胞中的表达.ppt
2、基因枪法（particle bombardment） ：是利用高速微弹粒将外源遗传物质导入细胞或组织中的方法，也称为微弹射击法、粒子轰击法等。最早由Klein TM在1987年创立，并将烟草花叶病毒RNA和CAT基因(Chloraphericol acetyltransferase氯霉素乙酰转移酶基因)导入洋葱表皮细胞。系统将带有包裹有目的基因的金属颗粒（金粒或钨粒），以很高的速度轰击植物细胞，由于小颗粒穿透力强，故不需除去细胞壁和细胞膜而进入基因组，从而实现稳定转化的目的。基因枪由激发器、枪管、挡板和无菌小室等组成。将一定量的带有目的基因的质粒DNA，CaCl2、亚精胺与钨粒一起离心或振
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外源基因在真核细胞中表达和调控.pptx
第七章??????外源基因在真核细胞中体现及调控
;第一节???????真核细胞基因体现旳调控
;第二节???????哺乳动物细胞体现系统旳选择标记基因
;第三节???????真核细胞体现系统旳载体种类
;一、真核生物基因体现旳特点及优势;二、真核细胞体现及调控元件;胸苷激酶;一、载体旳类型;二、几种常用旳真核体现载体;（一）真核生物基因转录水平旳调控;（二）转录后水平旳调控;（三）翻译水平旳调控;顺式作用元件;反式作用因子重要作用规律;不同构造域各自旳特性;RNA编辑（RNAediting）;翻译起始序列
;eIF-2旳磷酸化反映;一、胸苷激酶基因选择标记;二、二氢叶酸还原酶基因（DHFR）
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10 外源基因表达产物的分离纯化.ppt
A 重组蛋白分离纯化方法选择的基因原则 B 离子交换层析 C 凝胶层析 D 亲和层析 E 膜分离 F 原核生物表达的重组蛋白质量检测 D 亲和层析 亲和层析的基本概念 亲和层析是利用待分离物质与其特异性配体之间特异性的亲和力 进行分离的一类特殊的层析技术，它有如下特点： 纯化过程简单、迅速，且分离效率高 特别适用于分离纯化一些含量低、稳定性差的生物大分子 亲和层析的基本特点 纯化倍数大，产物纯度高 必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳定的层析条件 因此应用范围受到一定的限制 亲和层析的基本概念 抗原与抗体 DNA与互补DNA或RNA（cDNA、m
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基因工程课件15 外源基因表达产物的纯化.ppt
外源基因表达产物的纯化 生物与食品工程学院 蛋白质的纯化 在研究蛋白质的分子结构、组成、生物学功能和某些理化性质时，需要均一纯的甚至是结晶的蛋白质样品 分离纯化蛋白质的各种方法主要是利用蛋白质之间各种性质的差异 蛋白质分子的大小、形状 溶解度，酸碱性质，吸附性质等等 蛋白质的理化性质 蛋白质是由氨基酸组成的，它具有某些与氨基酸有关的性质。但它与氨基酸有着质的区别，表现出单个氨基酸所没有的性质 等电点 Isoelectric point, pI 离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。 蛋白质的理化性质 当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，净电荷
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第九章外源基因在真核细胞中的表达.ppt
第九章 外源基因在真核细胞中的表达 一、选择标记和报告基因 选择标记之一 二氢叶酸还原酶基因 选择标记之一 二氢叶酸还原酶基因 选择标记之二 胸苷激酶基因 选择标记之三 新霉素磷酸转移酶基因 选择标记之四 潮霉素磷酸转移酶基因 选择标记之五 氯霉素乙酰转移酶基因 选择标记之六 抗除草剂基因 选择标记之六 抗除草剂基因 报告基因 报告基因之一 β-葡糖醛酸糖苷酶基因 报告基因之二 氯霉素乙酰基转移酶基因 氯霉素的结构式 氯霉素催化的反应及检测方法 报告基因之三 荧光素酶基因 报告基因之四 冠瘿碱合成酶基因 冠瘿碱的检测方法 报告基因之五 绿色荧光蛋白基因 GFP的性质 绿色荧光蛋白 The
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第七章外源基因在真核细胞中的表达与调控.ppt
外源基因在真核细胞中的表达与调控 山东大学医学院免疫学系 王晓燕 基因重组的主要目的是要使目的基因在某一细胞中能得到高效表达，即产生人们所需要的高产目的基因产物，如蛋白质、多肽类生物药物。 基因工程技术的核心是基因表达技术。 基因表达是指结构基因在调控序列的作用下转录成mRNA，经加工后在核糖体的协助下又转译出相应的基因产物——蛋白质，再在受体细胞环境中经修饰而显示出相应的功能。从基因到有功能的产物这整个转录、转译及所有的加工过程就是基因表达的过程，它是在一系列酶和调控序列的共同作用下完成的。 一、概 述 （一）几个重要的概念 1、表达系统（gene expression sy
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7 外源基因的克隆与表达.ppt
1972 Paul Berg Herb Boyer Produced the first recombinant DNA molecules. They Shared the 1980 Nobel Prize in Chemistry for his fundamental studies of the biochemistry of nucleic acids, with particular regard to recombinant-DNA, （一）pBR322质粒是4362bp的环状双链DNA载体，有2个抗药性基因（四环素和氨苄青霉素），一个复制起始点和多个用于克隆的限制
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TCB10—2+外源基因导入真核细胞技术.pdf
外源基因导入真核细胞技术
外源基因在真核细胞内表达的意义
真核细胞提供重组的哺乳动物基因一个仿真的环
利于真核细胞内表达产物的生理作用研究
源于真核细胞的基因只有在真核细胞中的表达产物才
有特定的生理活性
真核细胞基因生理功能研究与基因改造和基因治疗
纯化大量重组的生物药品
随着分子生物学和细胞生物学研究的不断发展，转染
已经成为研究和控制真核细胞基因功能的常用手段之
一。如表达纯化特定蛋白；鉴定基因的生物学特性；
突变分析；信号通路研究等。影响转染效率的因素有
很多，细胞株本身的特性和活性、细胞培养
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真核细胞基因表达的调控..doc
MCB课程
真核细胞的基因表达和调控
一，生物体内遗传物质的基本结构和功能单位是基因
上个世纪70年代在细胞生物学，细胞遗传学和生物化学的基础上，经过一系列重大发
现而奠定基础，逐步发展形成了分子生物学(molecular biology)这一现代生命学科。分子
生物学认为生物体内存在着决定生物体性状的遗传物质，其基本的结构和功能单位是基
因(gene)。基因的本质是一段携带着能合成功能蛋白质所需的全部信息的DNA，其中包
括着蛋白质的编码序列，也包括非编码的调控序列。基因主要具有两大功能。一是指导
合成蛋白质，通过蛋白质发挥的功能将遗传信息转换成具体的细胞性
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人细胞角蛋白1基因的克隆、原核表达及纯化.pdf
JShanxiMedUniv．Feb2017．Vol48No2
人细胞角蛋白1基因的克隆、原核表达及纯化
王 博 ，侯卫坤 ，周 艳 ，蔡永松 ，王林玉 ，张 英 ，韩 燕 ，孟列素 (西安交通大学第一附属医
院转化医学中心，西安 710061；西安交通大学医学部基础医学院生物化学与分子生物学系；陕西省肿瘤精准医学重点实
验室；西安交通大学医学部附属红会医院关节病医院骨坏死与关节重建病区；西安交通大学第一附属医院皮肤科 ；西安
交通大学第一
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外源基因在宿主细胞中的表达1.doc
外源基因在宿主细胞中的高效表达- I 影响外源基因表达的因素
有效的转录起始
主要的限速步骤
选择强的可调控的启动子及相关的调控序列，是组建一个高效表达载体的首要问题
启动子:位于结构基因5’端上游区的DNA序列,活化RNA聚合酶
启动子的特征: 序列特异性、方向性、位置特性、种属特异性
举例说明原核生物的启动子和真核生物的启动子。
启动子根据作用方式及功能分类：
组成型启动子(constitutive promoter) ：在个体的任何细胞中均有表达活性的启动子
诱导型启动子
组织特异型启动子
最理想的强的可调控的启动子应该是：在发酵的早期阶段表达载体的启动
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外源基因在宿主细胞中的表达2.doc
外源基因在宿主细胞中的高效表达- II
表达系统与表达策略
基因的表达系统
大肠杆菌
基因在酵母中的高效表达
基因在昆虫细胞中的表达—杆状病毒表达系统
根据表达蛋白的用途选择基因的表达策略
(以利用大肠杆菌进行基因表达为例)
生物化学与分子生物学研究
着重考虑的问题是：如何保持蛋白质的原有功能不变
表达策略：直接表达天然蛋白（尽量可溶）
表达融合蛋白最好带有特异性酶切位点，可以将天然蛋白切下来）
表达蛋白用作抗原
获得包涵体
获得融合蛋白（如：带His6标签）
结构研究
要求：蛋白质必须是以可溶形式表达的
基因在大肠杆菌中的高效表达
(1)表
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外源基因在植物细胞中的表达.ppt
外源基因在植物细胞中的表达; 基因的体外重组和表达体系最早是利用大肠杆菌作为宿主，以后逐渐发展到真核生物细胞作为宿主，如酵母、植物细胞和动物细胞等。以植物细胞作为转化受体，不仅能把一些植物基因或DNA片段作为外源基因转化到受体植物，而且能把动物或微生物中存在的基因转化并整合到植物基因组中，使其在植物细胞中表达。; 外源基因在真核生物细胞中的表达，对于分子生物学理论研究，对真核生物基因表达调控的探讨提供了其他试验方法难以达到的有力手段。
外源基因如何才能转入真核细胞？又如何能从数量庞大的细胞群体中筛选出遗传转化的细胞？又是如何对转化的真核生物进行鉴定？;;（1）新
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真核细胞染色体结构与基因表达.ppt
感谢大家观看第31页,共31页，2024年2月25日，星期天关于真核细胞染色体结构与基因表达基因转录激活需要局部结构的改变染色体结构改变因素：组蛋白结构改变非组蛋白DNA甲基化和去甲基化第2页,共31页，2024年2月25日，星期天第一节
真核细胞染色质的组成与结构一、真核细胞染色体的组成1.染色质的基本成分组蛋白：每个核小体H2A、H2B、H3、H4各2个；1个H1。进化上保守，无组织特异性。两栖类、鱼类、鸟类红细胞H5取代H1非组蛋白：种类较多，与DNA折叠、复制、转录有关。高迁移蛋白（HMG）与DNA超螺旋结构有关。DNA第3页,共31页，2024年2月25日，星期天第4页,共31页，2