基因工程课件15 外源基因表达产物的纯化.ppt

外源基因表达产物的纯化 生物与食品工程学院 蛋白质的纯化 在研究蛋白质的分子结构、组成、生物学功能和某些理化性质时，需要均一纯的甚至是结晶的蛋白质样品 分离纯化蛋白质的各种方法主要是利用蛋白质之间各种性质的差异 蛋白质分子的大小、形状 溶解度，酸碱性质，吸附性质等等 蛋白质的理化性质 蛋白质是由氨基酸组成的，它具有某些与氨基酸有关的性质。但它与氨基酸有着质的区别，表现出单个氨基酸所没有的性质 等电点 Isoelectric point, pI 离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。 蛋白质的理化性质 当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。 没有同种电荷的排斥，溶解度小，易聚集沉淀各种蛋白的等电点不同，在同一pH时所带电荷不同，在一电场作用下移动的方向和速度也不同，所以可用电泳来分离提纯蛋白质。 调整溶液pH，使不同等电点的蛋白质在各自等电点 pI处依次沉淀下来 蛋白质的理化性质 利用蛋白质选择性吸附的性质 先吸附，再洗脱 a.离子交换吸附：利用阴、阳离子树脂 b.亲合色谱 是利用某些生物分子之间专一可逆结合特性的层析类型 将特殊结合分子固相化后，使存在液相中的相应蛋白质选择性地结合在固相载体上，借以与液相中的其他蛋白质分开，达到分离提纯的目的 是一种利用生物大分子间专一的亲和力进行分离，分析和纯化的色谱技术? 蛋白质的理化性质 蛋白质的大小和形状。 离心：蛋白质的沉降速度与分子大小和形状有关 过滤（超滤） 膜有各种不同的类型和规格 蛋白质的理化性质 蛋白质的大小和形状 凝胶过滤 ：又叫分子筛，大分子随洗脱液从颗粒间隙流下来，洗脱液体积小；小分子在颗粒网状结构中穿来穿去，历程长。 蛋白质的理化性质 蛋白质的大小和形状。 测得几种标准蛋白质的洗脱体积〔Ve〕 以相对分子质量对数对Ve作图，得标准曲线 再测出未知样品洗脱体积〔Ve〕 蛋白质的理化性质 沉淀 蛋白质在溶液中的稳定性是有条件的。 条件改变，破坏了蛋白质溶液的稳定性，蛋白质就会从溶液中沉淀出来。 蛋白质在溶液中靠水化膜和电荷保持其稳定性，水化膜和电荷一旦被除去，蛋白质溶液的稳定性就被破坏，蛋白质就开始粘在一起而形成较大的蛋白质点，最后从溶液中沉淀出来，此现象即为蛋白质的沉淀作用。 蛋白质的理化性质 可逆沉淀：在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。蛋白质结构和性质都没有发生变化，可以重新溶解形成溶液，是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。 蛋白质的理化性质 不可逆沉淀：在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。 加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀 蛋白质的理化性质 等电点沉淀 盐溶、盐析作用（硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等） 当盐浓度较低时，是蛋白质颗粒上吸附无机盐离子，加强与水分子的作用，溶解度增加。 当盐浓度很大时，一方面从蛋白质那里夺去水分，破坏蛋白质表面的水化层；另一方面，由于盐的离子浓度比较高，可以大量中和蛋白质颗粒上的电荷，从而容易聚集而沉淀。 不同的蛋白质盐析所需的盐浓度是各不相同的。因此，采用不同浓度盐溶液使不同的蛋白质分段沉淀析出就可以达到分离目的。 透析法 透析袋 只用于去除盐类和小分子杂质 不同表达形式采取不同的策略 分泌型重组蛋白，通常体积大、浓度低，因此应在纯化之前采用沉淀或超滤等方法先进行浓缩处理 包涵体重组蛋白，应先离心回收包涵体 融合型重组蛋白，一般是胞内可溶性的，拟首先选用亲和层析进行纯化 蛋白质分离纯化的流程 蛋白质分离纯化的流程 1. 前处理 首先把蛋白质从原有的组织细胞中溶解出来，并保持天然的活性。 如果所要的蛋白质集中在某一细胞组分中，如细胞核、染色体、核糖体等，可用差速离心方法将它们分开 如果蛋白质与细胞膜或膜质细胞器相结合，则必须利用超声波或去污剂使膜结构解聚，然后用适当的介质提取。 蛋白质分离纯化的流程 2、粗分离 将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开。这一步的分级分离的方法有盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等。 简便、处理量大，既能除去大量的杂质，又能浓缩蛋白质溶液。对于蛋白质提取液体积较大，不适于沉淀或盐析法浓缩，可用超滤、凝胶过滤、真空冷冻干燥等进行浓缩。 蛋白质分离纯化的流程 3、细分离 粗分离后大部分杂蛋白已被除去，样品经粗分级以后，一般体积较小，杂蛋白大部分已被除去。 进一步分离一般使用层析法包括凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析及亲和层析等。必要时可选择电泳法，包括区带电泳、等电聚焦等作为最后的纯化步骤。 蛋白质分离纯化的流程