基因工程的下游技术重组蛋白的表达、纯化和分析.ppt

4. 收集菌体。分别将1#-3#全部培养物收集到三个7mL离心管中，编上相应编号，离心弃上清；三角瓶培养的50mL菌液混匀后取5mL于7mL离心管中（编号为4#），离心，上清收集到另一个指管，编号为5#，其余的培养液用 50mL离心管于5000rpm，4℃，离心10min，弃上清，菌体用裂解缓冲液重悬后用超声波破碎细胞或保存于－20℃备用（见实验十二）。 5. 于紫外灯下观察1# -5#管收集的菌体或上清液，观察哪支管有荧光，记录观察到的现象。 注意：把1#和2#管置4℃保存。分别标Sample1和Sample2。 第三十页，共七十九页。 1＃ 2＃ 3＃ 6＃ pUC18 pGFPuv 挑取单菌落，接种于5mLLBA培养基中。 37℃过夜培养。 按1:100接种 对照 IPTG+Glc IPTG 第三十一页，共七十九页。 1＃ 2＃ 3＃ 6＃ 1＃ 2＃ 3＃ 4＃ 5＃ 25 ℃ -28℃培养过夜 5000rpm离心，收菌体 取5mL离心 其余离心收菌体，提取蛋白 第三十二页，共七十九页。 第三十三页，共七十九页。 第三十四页，共七十九页。 注意事项 本实验的目的是比较该重组DNA在大肠杆菌中表达时受IPTG和葡萄糖存在的影响。在转管培养及收菌时要注意各管编号要相应对好，不能混乱。 1#、2#管不加IPTG和葡萄糖。3#管除加IPTG外还加入葡萄糖（浓度要大于0.2%以上）。 6#瓶仅加IPTG 。 第三十五页，共七十九页。 不同的重组DNA在不同的宿主菌中蛋白的表达量往往受到IPTG浓度和培养温度的影响。在科研中一般都采用不同温度或不同浓度的IPTG来诱导，以获得最大的蛋白表达量。 本实验所表达的绿色荧光蛋白基因，其产物在大肠杆菌中有很强的荧光。离心后收集的菌体在紫外线的照射下可见黄绿色荧光，所以把1#、2#、3#、4#沉淀菌体放在紫外灯下观察其是否有荧光以及荧光的强弱，就可判断其是否有表达及其所表达的强度。 第三十六页，共七十九页。 实验安排 第一天： 上午配试剂，灭菌； 下午开始接种，约3 h-4h后开始诱导。（步骤2、3） 第二天： 收菌、紫外观察结果和拍照； 破碎细菌，分离上清，待过柱。 第三十七页，共七十九页。 思考与讨论 对紫外灯下观察到的结果作出解释。 为什么诱导表达的大肠杆菌要在其OD600浓度约为0.5时加入IPTG？ 大肠杆菌的诱导表达常受哪些因素的影响？ 第三十八页，共七十九页。 实验十二 金属鳌合亲和层析分离目的蛋白质 第三十九页，共七十九页。 实验目的 实验原理 材料与试剂 实验仪器 操作步骤 注意事项 实验安排 思考与讨论 第四十页，共七十九页。 一．实验目的 学习亲和层析的原理。 掌握亲和层析法分离蛋白质的技术与操作。 第四十一页，共七十九页。 实验原理 以普通凝胶作载体，连接上金属离子制成螯合吸附剂，用于分离纯化蛋白质，这种方法称为金属螯合亲和层析。 蛋白质对金属离子具有亲和力是这种方法的理论依据。已知蛋白质中的组氨酸和半胱氨酸残基在接近中性的水溶液中能与镍或铜离子形成比较稳定的络合物，因此，连接上镍或铜离子的载体凝胶可以选择性地吸附含咪唑基和巯基的肽和蛋白质。 第四十二页，共七十九页。 过渡金属元素镍在较低pH范围时（pH 6-8），有利于选择性地吸附带咪唑基和巯基的肽和蛋白质。在碱性pH时吸附更有效，但选择性降低。 金属螯合亲和层析在很大程度上，由被吸附的肽和蛋白质分子表面咪唑基和巯基的稠密程度所支配，吲哚基可能也很重要。 用IPTG诱导表达的蛋白质含有特定的组氨酸标签，这种可溶性蛋白质能用金属亲和层析法进行分离，且操作简单，快速，纯化效率高。 第四十三页，共七十九页。 材料与试剂 材料 含pUC18质粒工程菌及含重组pGFPuv质粒工程菌经诱导表达的细胞裂解蛋白。 试剂 0.05mol/L EDTA-0.5mol/L NaCl溶液 50mL 2mol/L NaCl 溶液 50mL 1mol/L NaOH溶液 50mL 0.2mol/L NiSO4溶液 30mL 第四十四页，共七十九页。 起始缓冲液：50mmol/L Tris-HCl; 500mmol/L NaCl; pH7.0 500mL Chelating Sepharose Fast Flow 4-5 mL 大肠杆菌细胞裂解蛋白样品 10-20mL 洗涤液：50mmol/L咪唑；50mmol/L Tris-HCl； 0.5mol/L N