重组蛋白的表达 纯化和分析.ppt

SDS，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）。SDS破坏蛋白质的二级和三级结构；强还原剂使半胱氨酸之间的二硫键断裂，因此，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物。这种复合物由于结合大量的SDS，降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异。而由于SDS与蛋白质的结合是按大小成比例的，在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数。 试剂 ①30%的凝胶贮备液: Acr 29g + Bis 1g溶于100mL去离子水中。避光贮存棕色瓶中。 ②3M Tris-HCl (pH8.9): 36.6g Tris-base + 48mL 1M HCl + dH2O至100mL ③5×Tris-甘氨酸电泳buffer（pH8.3): Tris-base15.1g + 甘氨酸94g + 5gSDS + H2O至1L（用时稀释5倍）。 ④10%SDS：10g SDS溶解于100mL去离子水中，贮存于室温中。 ⑤0.5M Tris-HCl(pH6.8): 6.05g Tris-base + 48mL 1M HCl + dH2O至100mL ⑥TEMED(四甲基乙二胺):浓度10%，20 mL (共用) ⑦10% AP(过硫酸铵):10 mL，1g AP溶解于10mL去离子水中，新鲜配制。 ⑧ 2x样品缓冲液： 100mM Tris-HCl(pH6.8) 200mM DTT(二硫苏糖醇) 4% SDS 0.2% 溴酚蓝 20% 甘油 ⑨ 考马斯亮蓝染色液：0.25g考马斯亮蓝R250溶于45mL甲醇中，加10mL冰醋酸 + H2O至100mL。（滤纸过滤除去不溶物） ⑩ 脱色液：75mL冰乙酸 + 50mL甲醇 + 875mL H2O（如只配500mL，各物质减半） 实验仪器 电泳仪、垂直板电泳装置、微量进样器（50μL）、染色/脱色摇床等。 操作步骤 胶板模型的安装：在干净的带隔板的玻璃板的三条边上把橡胶条压上，然后将另一块凹形玻璃板压上，放入电泳槽中。（示范） 12%分离胶的制备（每次配10 mL） 去离子水 3.2mL 30% 凝胶液 4.0mL 3mol/L Tris-HCl(pH8.9) 2.6mL 10% SDS 0.1mL 10% APS 0.1mL TEMED 0.005mL 用手轻摇约2分钟混匀(注意不要产生气泡）,小心将混合液注入准备好的玻璃板间隙中，为浓缩胶留足够的空间，轻轻在顶层加入几毫升去离子水复盖，以阻止空气中氧对凝合的抑制作用。刚加入水时可看出水与胶液之间有界面，后渐渐消失，不久又出现界面，这表明凝胶已聚合。再静置片刻使聚合完全。 ！注意：为避免凝胶过快聚合，配胶用的无离子水、30%的凝胶液及Tris-HCl缓冲液应事先于4℃或冰上放置,以下同。 浓缩胶的制备：先吸去已聚合好的分离胶上层的水，用水洗界面一次，再用滤纸吸干残留的水液。按下列配方制备5毫升浓缩胶溶液。混合后将其注入分离胶上端，插入梳子应小心避免气泡。 去离子水 3.2mL 30% 凝胶液 0.83mL 0.5M Tris-HCl(pH6.8) 0.75mL