第七章外源基因在真核细胞中的表达与调控.ppt

外源基因在真核细胞中的表达与调控 山东大学医学院免疫学系 王晓燕 基因重组的主要目的是要使目的基因在某一细胞中能得到高效表达，即产生人们所需要的高产目的基因产物，如蛋白质、多肽类生物药物。 基因工程技术的核心是基因表达技术。 基因表达是指结构基因在调控序列的作用下转录成mRNA，经加工后在核糖体的协助下又转译出相应的基因产物——蛋白质，再在受体细胞环境中经修饰而显示出相应的功能。从基因到有功能的产物这整个转录、转译及所有的加工过程就是基因表达的过程，它是在一系列酶和调控序列的共同作用下完成的。 一、概 述 （一）几个重要的概念 1、表达系统（gene expression system)： 基因工程中用来获得有功能的异源蛋白质的体系，包括表达载体的构建、受体细胞的建立及表达产物的分离、纯化。 （二）原核表达系统的局限性 1.缺乏翻译后加工修饰系统，不能进行糖基化、甲基化的修饰，影响某些蛋白的活性。 2.在原核细胞中表达的真核蛋白不稳定，易被细菌蛋白酶降解。 3.很难实现真正的分泌出胞，其产量很低，而且容易出现信号肽不被切割，或不在特异位置上切割。 4.表达产物常以包涵体（防止蛋白酶的水解）的形式存在，后期需要经过变性（盐酸胍或尿素）复性（二硫苏糖醇、巯基乙醇等还原剂），并且复性效率低。 5.内毒素的污染 转录前调控 1. 基因丢失：目前认为这种调节方式主要是在较低等的真核生物中。 2. 基因扩增：是指某些基因的拷贝数专一性大量增加的现象。 3. 基因重排：是指某些基因片段改变原来存在的顺序而重新排列组合。 4. 甲基化修饰： DNA甲基化是一种重要的基因组表观遗传修饰，参与调控许多细胞过程，包括胚胎发育、转录、染色质结构、X染色体失活、基因组印迹以及染色体稳定性。 5. 染色质结构对基因表达的调控： 细胞分裂时松开分散在核内的染色质称为常染色质，常染色质的基因可以转录。染色体中的某些区段到分裂期后，仍保持紧凑折叠的结构，在间期核中可以看到其浓集的斑块，称为异染色质，基因不能转录表达。 转录水平调控 1. RNA聚合酶: I, II, III 2. 顺式调控因子（cis-acting factor) 3. 反式作用因子（trans-acting factor) 顺式调控因子 顺式调控因子（cis-acting factor)：是与结构基因串连的、对基因转录的精确起始和转录活性具重要调控作用的特定DNA序列。包括正性调控元件（启动子、增强子）和负性调控元件（沉寂子、加尾和转录终止信号） 启动子 启动子（Promoter）: 位于基因的5端与基因转录起始有关的核苷酸序列。一般包括转录起始点及其上游100-200bp序列 作用特点：近距离作用、具有方向性、空间位置较恒定 分类： 核心启动子元件（转录起始点上游-30bp区的TATA-box）：决定基因转录精确起始。 上游启动子元件 (包括：-70至-80bp区域的CAAT盒及其两侧的GC盒):协同决定转录基础效率。 组织特异性元件:如肝细胞特异性启动子元件HP1，与白蛋白、AFP等基因在肝细胞中的特异性表达有关。 诱导性启动子元件：如cAMP反应元件（CRE），介导对cAMP、生长因子等信号的反应。 表－1　哺乳类RNA聚合酶Ⅱ启动子中 常见的元件 增强子 增强子(Enhancer): 是一类本身不具备启动子活性但能够促进转录活性的顺式调控元件。 构成：由单拷贝或多拷贝组件串连构成，长100-200bp，核心组件8-12bp。 作用特点： 远距离作用 无方向性 有启动子依赖性，但对启动子无严格专一性，因而无基因特异性。 组织特异性 相位性 负性调控元件 沉寂子（silencer)或衰减子(dehancer)：是一类抑制基因转录的顺式调控元件，作用方式同增强子。 转录终止信号： 加尾信号：AATAA,polyA上游10-20bp G/T簇：能形成发夹结构的反向重复序列 反式作用因子 反式作用因子（Trans-acting factor）: 由位于不同或相同染色体上相距较远的基因所编码的蛋白质因子，通过与顺式调控元件和RNA聚合酶的相互作用而调节基因转录活性。 反式作用因子可以分为3类： （1）普通转录因子（通用转录因子）：主要识别启动子的核心启动成分，如TATA盒结合因子TFIID； （2）组织特异性转录因子：是特殊组织与细胞中的反式作用因子，如淋巴细胞中的Oct-2； （3）诱导性反式作用因子：与反应性元件（response elements）相结合的反式作用因子。 如HSRE（热休克反应元件，heat shock response e