常用的微生物分离纯化方法.pdf

(一) 常用的微生物分离纯化方法 菌种分离纯化的方法有：稀释混合倒平板法、稀释涂布平板法、 平板划线分离法、稀释摇管法、液体培养基分离法、单细胞分离法、 选择培养分离法等。其中前三种方法最为常用,不需要特殊的仪器设 备, 分离纯化效果好, 现分别简述如下 1. 稀释混合倒平板法 平板是指经熔化的固体培养基倒入无菌培养皿中, 冷却凝固而 成的盛有固体培养基的平皿。该法是先将待分离的含菌样品, 用无菌 生理盐水作一系列的稀释(常用十倍稀释法, 稀释倍数要适当), 然后 分别取不同稀释液少许 (0.5-1.0ml)于无菌培养皿中, 倾入已熔化并 冷却至50℃左右的琼脂培养基, 迅速旋摇, 充分混匀。待琼脂凝固后, 即成为可能含菌的琼脂平板。 于恒温箱中倒置培养一定时间后, 在琼脂平板外表或培养基中 即可出现分散的单个菌落。每个菌落可能是由一个细胞繁殖形成的。 挑取单一个菌落, 一般再重复该法1-2次, 结合显微镜检测个体形态 特征,便可得到真正的纯培养物。若样品稀释时能充分混匀,取样量和 稀释倍数准确,则该法还可用于活菌数测定。 图4 混合倒平板操作法示意图 图5 涂布平板操 作法示意图 2. 稀释涂布平板法 采用上述稀释混合倒平板法有两个缺点，一是会使一些严格好氧 菌因被固定在琼脂中间,缺乏溶氧而生长受影响,形成的菌落微小难于 挑取；一是在倾入熔化琼脂培养基时，若温度控制过高,易烫死某些 热敏感菌，过低则会引起琼脂太快凝固, 不能充分混匀。 在微生物学研究中, 更常用的纯种分离方法是稀释涂布平板 法。该法是将已熔化并冷却至约50℃(减少冷凝水) 的琼脂培养基, 先 倒入无菌培养皿中, 制成无菌平板。待充分冷却凝固后,将一定量(约 0.1 ml) 的某一稀释度的样品悬液滴加在平板外表, 再用三角形无菌玻 璃涂棒涂布,使菌液均匀分散在整个平板外表, 倒置温箱培养后挑取 单个菌落。 另一种简单快速有效的涂布平板法, 可省去含菌样品悬液的稀 释, 直接吸取经振荡分散的样品悬浮液l滴参加1号琼脂平板上, 用 一支三角形无菌玻璃涂棒均匀涂布, 用此涂棒再连续涂布2号、3号、 4号平板(连续涂布起逐渐稀释作用，涂布平板数视样品浓度而定), 翻 转此涂棒再涂布5号、6号平板, 经适温倒置培养后挑取单个菌落。 该法可称之为玻璃涂棒连续涂布分离法。 3. 平板划线分离法 先倒制无菌琼脂培养基平板,待充分冷却凝固后,用接种环以无菌 沾取少量待分离的含菌样品,在无菌琼脂平板外表进行有规则的划 线。划线的方式有连续划线、平行划线、扇形划线或其它形式的划线。 通过这样在平板上进行划线稀释, 微生物细胞数量将随着划线次数 的增加而减少, 并逐步分散开来。经培养后,可在平板外表形成分散的 单个菌落。但单个菌落并不一定是由单个细胞形成的，需再重复划线 1-2次, 并结合显微镜检测个体形态特征, 才可获得真正的纯培养物。 该法的特点是简便快速。 图6 平板划线分离操作法示意图 个体细胞的生长难以测定, 而且生长与繁殖是交替进行的, 因 此，微生物的生长繁殖一般不是依据个体细胞的大小, 而是以群体细 胞数目的增加作为指标的。测定微生物细胞数量的方法很多, 主要有 显微镜直接计数法、平板菌落计数法、光电比浊法、最大可能数(MPN) 法、膜过滤法等。 测定酵母细胞数或霉菌孢子数常采用在显微镜下直接进行计数 的方法, 该计数方法被广泛应用于酒精、啤酒和白酒等的工业化生产 中。 平板菌落计数法