土壤微生物分离纯化及鉴定.doc

EM原液中细菌的计数、分离纯化、形态分析及鉴定 【摘要】 此次实验通过稀释涂布、划线分离等微生物实验的基本操作方法，对EM原液中的细菌进行分离纯化，然后观察记录菌落形态和显微镜下细菌的形态特征，结合革兰氏染色结果，对分离出的细菌进行鉴定。实验最终得到芽孢乳杆菌属，芽孢杆菌属，梭菌属，肠杆菌属，葡萄球菌属 【关键词】细菌，稀释涂布，分离纯化，形态分析，鉴定。 【前言】此次实验从EM原液中分离得到芽孢乳杆菌属，芽孢杆菌属，梭菌属，肠杆菌属，葡萄球菌属乳酸菌、酵母菌、芽孢杆菌、醋酸菌、双歧杆菌、放线菌七大类微生物中的10属80种微生物共生共荣，这些微生物能非常有效地分解有机物。它是由世界著名应用微生物学家日本琉球大学比嘉照夫教授在20世纪70年代发明的，EM技术是目前世界上应用范围最大的一项生物工程技术。只要使用恰当，它就会与所到之处的良性力量迅速结合，产生抗氧化物质，消除氧化物质，消除腐败，抑制病原菌，形成良好的生态环境。在种植、畜牧、水产、环保、饲料、人体家庭保健等方面都有显著作用。它具有改良土壤、增强光合作用、改善水质、除臭粪、促生长、抗病、改善畜禽品质、抑菌等功效。 比嘉照夫用“优势原则”来解释EM菌的有效性。EM菌可以分成三组：积极微生物（再生(regeneration)），消极微生物（分解，退化(decomposition, degeneration)）以及机会主义微生物。在不同的环境中（水，土壤，空气或人的肠道），“积极”和“消极”微生物的比例是至关重要的，由此机会主义微生物就顺应再生或者退化的趋势。比嘉照夫相信由于微生物的这种特性对不同环境有着积极的影响。和一般生物制剂相比，它具有结构复杂、性能稳定、功能齐全的优势，表现出前所未有的高科技水平。迄今为止，EM已狂风般席卷日本、美国、巴西、法国、台湾等90多个国家和地区。 细菌种类繁多。从复杂的微生物群体中获得只含有一种或一株微生物的过程称为微生物的分离纯化。通过稀释涂布平板法可以在平板上获得单菌落，再通过挑取单菌落进行平板划线分离可获得纯培养。在稀释涂布平板法中还可通过平板菌落计数，推算单位EM原液中含有的细菌的数量。对微生物分类的主要依据有形态特征、生理生化特征等。形态特征包括个体形态和培养形态，这些特性可被用作细菌的分类和鉴定。 1.材料与方法 1.1材料 1.1.1菌液：EM菌原液（Effective Microorganisms） 1.1.2试剂： 革兰氏染色用卢戈氏碘液 1.1.3仪器和其他用品： 试管，平皿，移液管，烧杯，三角瓶，玻璃珠，量筒，玻璃棒，天平，pH试纸，高压蒸汽灭菌锅，电热套，载玻片，盖玻片，镊子，接种环，酒精灯等。 1.2.方法 1.2.1实验准备 准备实验所需仪器与药品，按照配方配配方如下：蛋白胨 10g5g，氯化钠(NaCl) 5gpH调节到7.0。并对仪器和培养基进行灭菌。 1.2..2梯度稀释 1.2.2.1无菌操作，移取1mlEM菌原液至带玻璃珠的无菌90mL无菌水的三角瓶中，充分摇匀20min，将菌分散用移液管吸取上述菌液1毫升，放入盛有9毫升无菌水的试管中，稀释成10-3的菌液。10-4、10-5、10-6倍浓度的梯度稀释液。 1.2.2.3分别从10-10-5、10-6倍的菌液中吸取1毫升菌液同一稀释液重复3个。将培养皿倒置在℃恒温箱中培养2天。 1.2.2.5经过一定时间培养后，菌落特征 对平板上的菌落数量进行计数。同一梯度取三个平板菌落数的平均值。 1.2.4划线分离 从平板中挑取单个细菌菌落，注意选择形态特征有明显差异的菌落。在LB培养基上进行划线分离。 1.2. 5斜面接种取制成水浸片算出目镜测微尺每格所代表的长度。制成水浸片。 对分理出的菌种分别进行革兰氏染色。革兰氏染色步骤：制片、固定，草酸铵结晶紫染1分钟去掉浮色。用碘液媒染1分钟，倾去多余溶液。用乙醇（95%）脱色干燥后，置油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌即被区别开。1.2. 6.4细菌芽孢染色 涂片、干燥、固定滴加孔雀绿染液倾去染液，水洗至不褪色为止min水洗至流出水无色。镜检。 2结果与分析 2.1结果 表1-1：菌液计数 稀释倍数及菌落数 EM原液中含有的细菌群落总数 （取两位有效数字） 10-4 10-5 10-6 1 84 26 4 254333 2.5x106 2 76 30 2 3 89 29 5 平均 83 28 4 表1-2： 菌落形态的观察记录 菌落编号 1号 2号 3号 4号 5号 菌落直径/mm 1~2 3~4 2~3 2~3 2~3 菌落形态 圆点 圆点 圆点 圆点 圆点 菌落是 否突起 是 是 是 是 是 菌落颜色 乳白 白色 白色